Zrozumienie mechanizmów komórkowych to jedno z głównych zadań mikroskopii fluorescencyjnej. Aby poznać odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące wpływu bodźców zewnętrznych na komórki, takich jak warunki środowiskowe czy mutacje genomu, niezbędna jest szczegółowa analiza położenia pojedynczych cząsteczek i organelli, a także oddziaływań zachodzących wewnątrz i pomiędzy komórkami. Co więcej, precyzyjna kwantyfikacja uzyskanych wyników pozwala na dopełnienie pełnego obrazu analizowanych procesów.

Oxford Nanoimaging to start-up, który powstał w 2016 r. na Uniwersytecie Oksfordzkim. Misją firmy jest udostępnianie najbardziej zaawansowanych technik mikroskopii fluorescencyjnej naukowcom, dla których prowadzenie takich eksperymentów było dotąd niemożliwe.  To pozwoli na wykorzystanie pełnego potencjału wysokorozdzielczej mikroskopii lokalizacyjnej zarówno w podstawowych badaniach biologicznych, jak i diagnostyce chorób, na poziomie pojedynczych cząsteczek. Nanoimager został skonstruowany w grupie prof. Achillefsa Kapanidisa przez wiodących na świecie ekspertów w dziedzinie mikroskopii wysokorozdzielczej. Ich wiedza i doświadczenie pozwoliły na stworzenie i dopracowanie prostego i wszechstronnego mikroskopu fluorescencyjnego, który pozwala na obrazowanie z rozdzielczością sięgającą 20 nm.

Jak działa wysokorozdzielcza mikroskopia lokalizacyjna?

W konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej cząsteczki fluoroforów znajdują się zbyt blisko siebie by można było określić ich położenie z precyzją mniejszą niż 200 nm. Podstawą działania wysokorozdzielczej mikroskopii fluorescencyjnej jest zastosowanie fluoroforów, które mogą wielokrotnie przechodzić ze stanu nieaktywnego, tzw. ciemnego, do stanu aktywnego, jasnego, w którym emitują fotony. Podczas obrazowania, jedynie część fluoroforów jest wprowadzana w stan aktywny tak, że położenie ich centroidów może zostać określone z precyzją sięgającą 20 nm. Następnie są one wygaszane i kolejna frakcja fluoroforów zostaje aktywowana. Proces ten powtarza się kilka tysięcy razy, aż do momentu, w którym zidentyfikowane pozycje pojedynczych cząstek pozwolą na puentylistyczną rekonstrukcję obrazu analizowanej struktury (w STORM) lub szczegółowy opis dynamiki analizowanych molekuł (w technice PALM).

Techniki dSTORM, PALM i smFRET

Nanoimager pozwala na badanie wnętrza komórek z 20 nm precyzją lokalizacji. To, w połączeniu z wysoką specyficznością znakowania immunofluorescencyjnego, umożliwia szczegółowe obrazowanie i kwantyfikację uzyskanych informacji. Jednym z najczęstszych zastosowań wysokorozdzielczej mikroskopii lokalizacyjnej jest technika dSTORM, wykorzystywana do badania architektury różnorodnych struktur komórkowych, badania kolokalizacji cząstek, stechiometrii kompleksów, które tworzą położenia pęcherzyków transportujących, wirusów i wielu innych. Na zdjęciu przedstawiono wysokorozdzielczą rekonstrukcję obrazów mikroskopowych komórek MDBK, w których jednocześnie wyznakowano mikrotubule oraz aktynę.

Śledzenie pojedynczych cząstek (ang. single particle tracking), w tym PALM, pozwala na śledzenie pojedynczych fluoroforów, zrozumienie ich dynamiki, trajektorii ruchu oraz oddziaływań pojedynczych cząstek zarówno w roztworze, jak i w żywych komórkach. Doskonałym przykładem może być śledzenie znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek polimerazy RNA w komórkach Escherichia coli, które możecie zobaczyć na filmie poniżej. Położenie pojedynczych cząsteczek zostało poddane mapowaniu z wykorzystaniem oprogramowania NimOS, co pozwoliło na określenie ich współczynników dyfuzji i wyznaczenie czasu reakcji.

Jako pierwszy komercyjnie dostępny mikroskop, Nanoimager pozwala na badania z wykorzystaniem techniki smFRET (ang. single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer). FRET to zjawisko przenoszenia energii między dwoma fluoroforami (‘donor’ i ‘akceptor’) o różnych widmach absorpcji i emisji, na drodze innej niż promieniowanie. Jeśli cząsteczki ‘donora’ i ‘akceptora’ znajdują się w odległości nie większej niż 10 nm, po wzbudzeniu ‘donora’ wiązką o długości fali odpowiadającej maksimum jego absorpcji, obserwuje się emisję fluorescencji o długości odpowiadającej maksimum emisji ‘akceptora’. smFRET pozwala na pomiary odległości w obrębie pojedynczej lub pomiędzy odrębnymi cząsteczkami DNA, RNA i białek, w czasie rzeczywistym. Oprogramowanie NimOS umożliwia kwantyfikację i charakteryzacje m.in. dynamiki przemian strukturalnych w obrębie pojedynczych cząsteczek, specyficznych oddziaływań i tworzenia kompleksów czy też pomiary kinetyki i czasów reakcji.

Poznaj Nanoimagera

Nanoimager pozwala na obrazowanie próbek wybarwionych nawet czterema rożnymi fluoroforami, a wybrane dwa kanały emisji można obserwować jednocześnie. To, w połączeniu z możliwością obrazowania w trybie trójwymiarowym z zastosowaniem astygmatycznej soczewki, pozwala na uzyskanie maksymalnej precyzji w badaniach nad kolokalizacją i dynamiką dwóch różnych rodzajów cząstek. Temperatura całej objętości mikroskopu podlega regulacji i może sięgać 37°C, co pozwala na długotrwałe pomiary mikroskopii przyżyciowej i zapobiega występowaniu lokalnych gradientów temperaturowych.

W zależności od rodzaju próbki, użytkownik może wybrać jeden z trzech typów iluminacji: Epi, TIRF i HILO. Epifluorescencja to najbardziej popularny typ obrazowania, w którym wiązka lasera przechodzi przez całą grubość iluminowanego obszaru, wykorzystywany najczęściej w mikroskopii próbek grubszych niż 10 µm. W tym typie obrazowania sygnał fluorescencyjny, pochodzący spoza płaszczyzny ostrości, jest najwyższy. W TIRF (ang. Total Internal Reflection Fluorescence) jedynie 200 nm próbki przy powierzchni szkiełka podlega iluminacji, co pozwala na wyeliminowanie fluorescencyjnego sygnału spoza płaszczyzny ostrości. W przypadku iluminacji HILO (ang. Highly Inclined and Laminated Optical sheet) wiązka laserowa przenika próbkę pod kątem ostrym, znacznie redukując fluorescencyjny sygnał tła. Ten typ obrazowania stosuje się najczęściej w przypadku próbek o grubości do 10 µm.

Niezwykle przydatną funkcją Nanoimagera jest tzw. z ang. Overview scan, który zastępuje tradycyjnie stosowany okular. Funkcja ta umożliwia szybkie mapowanie preparatu, identyfikację interesujących regionów, a także poruszanie się pomiędzy nimi z możliwością powrotu do poprzednich pozycji. Niewielkie wymiary Nanoimagera pozwalają na redukcję aberracji i skrócenie ścieżki optycznej, a także na pracę przy ograniczonej przestrzeni. Specjalistyczne materiały wykorzystane do konstrukcji Nanoimagera zapewniają tłumienie wibracji i minimalny dryf próbki. Dodatkowo, jako produkt 1. klasy w zakresie bezpieczeństwa laserowego, Nanoimager może być używany w dowolnym pomieszczeniu i laboratorium.

Oprogramowanie NimOS

Inteligentne oprogramowanie NimOS pozwala na szybką i intuicyjną analizę obrazów mikroskopowych, uzyskanych zarówno podczas obrazowania epifluorescencyjnego, wysokorozdzielczego, jak i smFRET. Podczas akwizycji obrazu, położenie centroidów, cząstek fluoroforów, jest identyfikowane w czasie rzeczywistym. To umożliwia analizy uzyskanych danych bezpośrednio po eksperymencie.

Moduł dedykowany analizie zapewnia sprawną wizualizację danych, a wbudowane narzędzia umożliwiają pomiary dynamiki cząstek, ich gęstości oraz wielkości, intensywności fluorescencji, wydajności FRET, inteligentnej wizualizacji trójwymiarowej i wiele innych. Dodatkowo, opcja zastosowania skryptów Python we wbudowanej konsoli pozwala użytkownikowi na komunikację zarówno z narzędziami pomiarowymi jak i analitycznymi oprogramowania NimOS. Na potrzeby dalszych analiz, Oxford Nanoimaging oferuje również dedykowane moduły oprogramowania przygotowane zgodnie z wymaganiami klienta. Zachęcamy do obejrzenia filmu dostępnego pod artykułem.

Nanoimager to prawdziwa rewolucja w dziedzinie mikroskopii wysokorozdzielczej. Jest to intuicyjne, kompaktowe urządzenie z dedykowanym oprogramowaniem, które może być używane w dowolnym pomieszczeniu, bez potrzeby specjalistycznego stołu optycznego, ciemni czy też komory temperaturowej. Jako wszechstronny mikroskop fluorescencyjny, Nanoimager pozwala na obrazowanie zarówno metodą tradycyjnej mikroskopii epifluorescencyjnej, jak i mikroskopii wysokorozdzielczej, z precyzją sięgającą 20 nm, w preparatach przyżyciowych, utrwalonych, a także w roztworze.

Co najważniejsze, Nanoimager jest udoskonalany każdego dnia, aby sprostać wymaganiom użytkowników na całym świecie i pozwolić im na wykorzystanie pełnego potencjału wysokorozdzielczej mikroskopii lokalizacyjnej.

Dr Katarzyna Ginda, Oxford Nanoimaging

www.oxfordni.com
www.labnatek.pl