Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Renaturacja białek rekombinowanych? Polscy specjaliści robią to skutecznie
Renaturacja białek rekombinowanych? Polscy specjaliści robią to skutecznie
W tym roku mijają 32 lata odkąd pierwsze rekombinowane białko, powstałe dzięki inżynierii genetycznej zostało zatwierdzone jako lek i dopuszczone do leczenia u ludzi. Ludzka insulina rekombinowana, bo o niej mowa, zapoczątkowała nową erę w medycynie. Dziś białka rekombinowane stosuje się powszechnie w terapiach wielu chorób onkologicznych, autoimmunologicznych, neurologicznych, genetycznych, krwi czy infekcji.

Choć farmakoterapia z użyciem leków biologicznych ma dłuższą historię,  to w przypadku białek największym krokiem milowym było opracowanie i popularyzacja techniki otrzymywania ich na drodze rekombinacji. Wcześniej procesy izolacji oraz oczyszczania pożądanych terapeutyków były długie, skomplikowane, a przede wszystkim kosztowne. Główny rezerwuar białek wykorzystywanych w medycynie stanowiły zwierzęta. Niosło to zagrożenia wynikające z różnic funkcjonalnych wykazywanych przez białka pobrane z innych gatunków oraz możliwość skażenia preparatu np. wirusami występującymi i transmitowanymi w królestwie zwierząt. Problemem była też niska wydajność procesu izolacji białek w zestawieniu z wciąż rosnącym zapotrzebowaniem. Dlatego wytwarzanie rekombinowanych białek in vitro stało się przełomem, który w znaczący sposób zwiększył wydajność produkcji leków, a zagrożenia związane z niezgodnością biologiczną i przenoszeniem czynników chorobotwórczych zmniejszył praktycznie do minimum.

Niezbędne białka

Białka jako złożone, wielkocząsteczkowe związki pełnią szereg kluczowych funkcji niezbędnych do prawidłowej pracy ludzkiego organizmu. Zaburzenia naturalnej ekspresji i aktywności protein w ludzkim organizmie często są powodem różnych chorób, tak jak ma to miejsce w przypadku wspomnianej już insuliny. Niedobór tego hormonu peptydowego skutkuje cukrzycą. Większość terapii schorzeń spowodowanych anormalną produkcją białek opiera się na uzupełnianiu powstałych braków lub dostarczeniu do organizmu pacjenta preparatów o odpowiedniej aktywności. Systemy ekspresji in vitro rekombinowanych białek pozwalają tanio, szybko i bezpiecznie  produkować duże ilości łatwo oczyszczalnego białka terapeutycznego.

"Białka to cząsteczki bardzo złożone, heterogenne, których nie można otrzymać metodami chemicznymi, dlatego do ich produkcji wykorzystuje się narzędzia biotechnologiczne" – przypomina dr Filip Jeleń, prezes spółki Pure Biologics.

Białka rekombinowane

Proces produkcji białek rekombinowanych in vitro składa się z 3 etapów. Na początku metodami inżynierii genetycznej konstruuje się wektor ekspresji zawierający kasetę ekspresyjną, w skład której wchodzi gen kodujący sekwencję aminokwasową pożądanego białka. Często już na tym etapie ramkę odczytu genu, którego ekspresja prowadzi do produkcji rekombinowanego białka wzbogaca się o dodatkowe sekwencje wprowadzające zmiany strukturalne lub funkcjonalne. Ich zadaniem jest poprawa właściwości ostatecznego produktu np. zwiększenie odporności na termiczną denaturację, wpływ na specyficzność oddziaływań, czy też poprawa stabilności w określonym zakresie pH. Popularnym zabiegiem jest również stosowanie dodatkowych sekwencji krótkich peptydów lub domen białkowych ułatwiających późniejsze oczyszczanie na drodze chromatografii powinowactwa. Należy dobrać też odpowiedni układ wektor-gospodarz i określić jaki system zostanie wykorzystany do ekspresji. Następnym etapem jest transformacja komórek plazmidem zawierającym opracowany wcześniej konstrukt genowy. Po ustalonym czasie hodowli z zebranych komórek oczyszcza się namnożone białko, analizuje jego właściwości i doprowadza do pożądanej formy, umożliwiającej np. testy kliniczne, transport czy przetrzymywanie.

Systemy ekspresyjne

Współczesna biotechnologia umożliwia produkcję rekombinowanych białek przy pomocy różnych systemów ekspresji wykorzystujących zarówno bakterie, grzyby jak i hodowle komórek eukariotycznych. Najlepiej poznanym, przez co także najpopularniejszym modelem biosyntezy białka jest pałeczka okrężnicy Eschierichia coli. Dla bakterii tej charakterystyczne są stosunkowo wysoki poziom ekspresji, dobrze zdefiniowane układy transkrypcji i translacji, a przede wszystkim niskie koszty hodowli. Podczas ekspresji w E. coli nie zachodzą jednak modyfikacje potranslacyjne, przez co produkcja niektórych białek eukariotycznych jest niemożliwa. Z racji ograniczonej wielkości klonowanego DNA, które jest w stanie przyjąć komórka E. coli, maksymalny rozmiar białka jakie można wyprodukować przy pomocy tych mikroorganizmów to ok. 100 kDa. Mimo wszystko system ten jest powszechnie i z powodzeniem wykorzystywany do produkcji interferonu, ludzkiej albuminy, hormonu wzrostu i prawie wszystkich enzymów stosowanych w diagnostyce i biologii molekularnej. Innym bardzo popularnym modelem ekspresji białek rekombinowanych są bakterie z rodzaju Bacillus. Przewagą tych mikroorganizmów jest  przede wszystkim zewnątrzkomórkowa sekrecja wielu białek do podłoża hodowlanego. W znacznym stopniu ułatwia to późniejsze oczyszczanie finalnego produktu. Jednym z problemów bakteryjnych platform ekspresji jest możliwość przedostawania się niektórych endotoksyn komórki gospodarza do rekombinowanego polipeptydu i zanieczyszczenie preparatu. W przypadku gdy zanieczyszczeniu ulega białko terapeutyczne, u pacjenta dojść może do reakcji zapalnych lub wtórnych zakażeń. Dlatego podczas produkcji rekombinowanych białek z pomocą prokariotycznych platform ekspresji największy nacisk kładzie się na dokładne procesy oczyszczania i późniejszą analizę czystości produktu.

"Nieraz wydostanie czystego, pojedynczego, homogennego białka z mieszaniny powstałej po homogenizacji komórek rozpatruje się w kategorii sztuki. Produkcja zdefiniowanych białek o wysokim współczynniku czystości to obecnie jedno z największych wyzwań dla biotechnologów zajmujących się produkcją rekombinowanych protein" –  opowiada dr Filip Jeleń.

Eukariotyczne systemy ekspresji białek rekombinowanych pozwalają na przeprowadzanie modyfikacji posttranslacyjnych. I tak na przykład komórki drożdży  Saccharomyces cerevisiae potrafią przeprowadzić glikozylację produkowanych białek, jednak należy pamiętać, że w wielu przypadkach glikoproteiny wytwarzane przez grzyby różnią się od glikoprotein ssaczych. Do dość powszechnych problemów należą również trudna transformacja oraz niewielka liczba dostępnych wektorów możliwych do użycia w systemach drożdżowych. W przypadku gdy biotechnolog ma za zadanie produkcję eukariotycznego białka, posiadającego szereg modyfikacji posttranslacyjnych może skorzystać z systemu ekspresji w komórkach ssaczych np. CHO, czy HeLa. Do niewątpliwych zalet ssaczego systemu ekspresji należą przede wszystkim proces posstranslacyjnej glikozylacji,  możliwość wyprowadzania ciągłych linii komórkowych i zewnątrzkomórkowa ekspresja białek. Hodowla komórek eukariotycznych jest jednak skomplikowana i bardzo wrażliwa na zanieczyszczenia, a podłoża hodowlane są kosztowne.

Nadekspresja genów i nadprodukcja białek

Głównym celem produkcji rekombinowanych białek in vitro jest pozyskanie ich w dużych ilościach, czyli tzw. nadprodukcja wywołana zaplanowaną nadekspresją genów.  Aby ostateczny produkt był satysfakcjonujący, pod uwagę trzeba wziąć szereg czynników, począwszy od wyboru i optymalizacji hodowli komórek, opracowania funkcjonalnych  konstruktów genowych możliwych do zastosowania w danym systemie biosyntezy białka, poprzez analizę i zgłębianie mechanizmów zwijania białek, po ciągłe unowocześnianie metod oczyszczania i renaturacji protein.  Wszystkie te czynniki wpływają na ilość, rozpuszczalność, a przede wszystkim na jakość rekombinowanego białka. Im rekombinowany polipeptyd jest dłuższy, im więcej zawiera reszt proliny, cysteiny, reszt hydrofobowych i skrętów, tym trudniej otrzymać duże ilości produktu o pożądanej strukturze.

"W wielu przypadkach, w których chcemy wyprodukować ludzkie białko za pomocą narzędzi biotechnologicznych np. mikroorganizmów, dochodzi do sytuacji, w której bakteria produkuje białko w formie nierozpuszczalnej. Białko, aby pełnić swoje funkcje musi przybrać odpowiednią strukturę, co często nie zachodzi podczas nadekspresji w bakteryjnych systemach biosyntezy" – tłumaczy prezes Pure Biologics.

Renaturacja białek

W każdym procesie produkcji wykorzystującym systemy nadekspresji białek dąży się do otrzymania homogennych produktów w formie rozpuszczalnej. Często jednak nadprodukcja białek stanowi nawet 50 % wszystkich protein komórki gospodarza, a zbyt intensywna biosynteza może być powodem agregowania produktów. Nagromadzenie się takich agregatów utworzonych z białek, które wchodzą w niespecyficzne hydrofobowe interakcje prowadzi do powstawania nierozpuszczalnych ciał inkluzyjnych. W przypadku gdy nadekspresjonowane białka są otrzymywane w formie nierozpuszczalnej, nie posiadają natywnej struktury i funkcji biologicznych, muszą zostać poddane procesowi refałdowania, niezbędnego do uzyskania pożądanych właściwości. Ciała inkluzyjne zwykle składają się w około 90 % z białka pozbawionego właściwej konformacji, modyfikacji posttranslacyjnych i niezdolnego do utworzenia mostków disiarczkowych, dlatego ich renaturacja to proces skomplikowany i kosztowny.

Wydajna nadprodukcja rekombinowanych białek do formy rozpuszczalnej wymaga przetestowania wielu kombinacji warunków prowadzenia całego procesu. W przypadku prób renaturacji i oczyszczania białek zdeponowanych w ciałkach inkluzyjnych należy zoptymalizować pH stosowanych buforów, temperaturę i siłę jonową. Istotna jest również  właściwa selekcja detergentów i ich stężeń, a także odpowiedni dobór soli chaotropowych, czynników redukcyjnych, związków chelatujących, jonów metali niskocząsteczkowych, czy dodatków ułatwiających refałdowanie białek, takich jak glicyna lub L-arginina.

 

 

Istnieją jednak firmy, które wyspecjalizowały się w otrzymywaniu funkcjonalnych preparatów na drodze refoldingu białek. W Polsce wiodącym przedsiębiorstwem, które może pochwalić się sukcesami w tym obszarze jest Pure Biologics z Wrocławia. Firma ta prowadzi kompleksowy proces „od genu do białka”, począwszy od optymalizacji sekwencji DNA i otrzymywania konstruktów, poprzez produkcję biomasy z użyciem bakteryjnych i eukariotycznych platform ekspresyjnych, do dostarczenia oczyszczonego, homogennego produktu białkowego. Co ważne, Pure Biologics odnosi sukcesy w skutecznym otrzymywaniu funkcjonalnych preparatów na drodze refałdowania białek.

"Używamy własnej technologii opartej na masowym testowaniu macierzy szeregu starannie dobranych warunków, w których prowadzona jest renaturacja białek. Platforma testowa warunków renaturacji białek składa się z setek różnych kombinacji składu buforów i dodatków. Dzięki temu maksymalizujemy szanse utworzenia optymalnego środowiska umożliwiającego sprawną i wydajną renaturację białek do postaci natywnej z odzyskaniem ich pełnej aktywności biologicznej" – mówi dr Jeleń.

Platformy produkcji białek rekombinowanych stosowane przez Pure Biologics charakteryzują się innowacyjnym podejściem technologicznym, które bazuje na wysokowydajnych testach przesiewowych z użyciem optymalnego schematu składu buforów i odpowiednich dodatków poprawiających stabilność otrzymywanych białek. Taka metodologia zaowocowała wysoką skutecznością w renaturacji nieaktywnych białek produkowanych w formie nierozpuszczalnej.

"Dzięki naszej technologii, opartej na macierzy warunków testowych do optymalizacji protokołów renaturacji białek, otrzymaliśmy szereg aktywnych związków biologicznych testowanych następnie w badaniach przedklinicznych w obszarze onkologii." – dodaje prezes wrocławskiej spółki. 

Źródła

1. Kurcek A., "Białka rekombinowane", http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Bialka-rekombinowane/, dostęp 08.08.2014

2. Stryer L., 2009. Biochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa.

3. Nuc P., Nuc K., Produkcja rekombinowanych białek w Escherichia coli, Postępy Biochemii 52 (4) 2006, st 448-456.

 

KOMENTARZE
news

<Wrzesień 2018>

pnwtśrczptsbnd
27
28
29
30
31
1
2
3
4
5
7
8
9
10
16
17
19
21
MEDmeetsTECH #6
2018-09-21 do 2018-09-21
22
23
24
Międzynarodowy Kongres Biogospodarki
2018-09-24 do 2018-09-24
25
IT w Służbie Zdrowia GigaCon
2018-09-25 do 2018-09-25
28
29
30
Newsletter