Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Walka z antybiotykoopornością – czy grozi nam powrót do ery preantybiotykowej?
Walka z antybiotykoopornością – czy grozi nam powrót do ery preantybiotykowej?
W związku z powszechnym i często nierozważnym stosowaniem antybiotyków, nie tylko w leczeniu chorób u ludzi, ale także dodawaniu ich do pasz dla zwierząt i mimo wprowadzenia w ostatnich latach coraz bardziej restrykcyjnych rozporządzeń i wytycznych, mamy coraz większy problem z rozwojem różnych mechanizmów antybiotykooporności wśród bakterii. Rangę problemu stanowi dodatkowo fakt, że wiele antybiotyków, które są obecnie stosowane zostało wprowadzonych do leczenia wiele lat temu, a obecnie nie zostały odkryte nowe punkty uchwytu antybiotyków w komórkach bakteryjnych. Poszukiwane są zatem alternatywne metody, dzięki którym możliwe będzie unieszkodliwienie wieloopornych bakterii.

 

Pierwszą [1] z metod, która otwiera nowe możliwości w walce z antybiotykoopornością jest dostarczanie bakteriocyn (produkowanych naturalnie przez bakterie białek przeciwbakteryjnych w stosunku do konkurencyjnych szczepów) do organizmu, przy użyciu bakterii komensalnych. Pokonując w ten sposób problem małej stabilności bakteriocyn oraz reakcji immunologicznej ze strony gospodarza, bakterie komensalne w organizmie ludzkim przejęłyby role czynnika przeciwbakteryjnego zabezpieczającego przed kolonizacją patogenami oraz produkcją toksyn bakteryjnych.

Postęp inżynierii genetycznej pozwala natomiast na wykorzystanie kilku innych metod bazujących na modyfikacji genów bakteryjnych [1]:

Jednym z wariantów jest użycie Quorum sensing (QS) [2] – metody komunikacji między bakteriami, która polega na produkowaniu, wykrywaniu i reagowaniu na zewnątrzkomórkowe cząsteczki sygnałowe (Als). Gromadzące się w środowisku Als wpływają m.in. na modyfikację ekspresji genów bakteryjnych. Wzrastająca liczba bakterii powoduje wzrost stężenia Als w środowisku, wykrywany przez receptory cytoplazmatyczne i błonowe przekazując informację na temat wyhamowania podziałów komórkowych, produkcji antybiotyku, toksyn czy tworzenia biofilmu.

W badaniach [1] wykorzystywany jest system QS z Pseudomonas aeruginosa, wprowadzony do zmodyfikowanych genetycznie Escherichia coli, aby w odpowiedzi na obecność P. aeruginosa wydzielały przeciwbakteryjne bakteriocyny – pyociny. Później dodatkowo zmodyfikowano mechanizm dodając geny pozwalające na „podążanie” E. coli w kierunku wykrytego patogenu oraz syntezę enzymu uniemożliwiającego tworzenie biofilmu przez patogen. Ostatnio podobną strategię stosuje się dla bakterii probiotycznych jak Lactococcus lactis wprowadzając do nich mechanizmy rozpoznające takie patogeny jak: patogenne E. coli, Salmonella spp. czy Enterococcus faecalis.

Innym podejściem jest wzmacnianie działania już istniejących antybiotyków. Podobny mechanizm jest już stosowany od dawna w postaci kwasu klawulanowego w celu poprawy działania antybiotyków β-laktamowych poprzez unieszkodliwienie β-laktamaz – enzymów rozkładających antybiotyki β-laktamowe. Obecnie zaobserwowano, że ekstrakty bezkomórkowe z bakterii probiotycznych jak L. plantarum wpływają na działanie antybiotyków – zmniejszają minimalne stężenie hamujące wzrost bakterii (MIC) dla Salmonella. Działanie antybiotyków poprawiają także enzymy promujące rozpraszanie biofilmu, dzięki pozytywnemu wpływowi na penetrację antybiotyku.

Obiecującą metodą jest również stosowanie bakteriofagów [1,5] w celu transformacji bakterii genami wpływającymi na przeżywalność, kierującymi na drogę śmierci oraz zaburzającym syntezę mechanizmów antybiotykooporności. Tę ostatnią wykorzystano do tłumienia szlaku SOS [3,4], który jest odpowiedzialny za naprawę DNA po uszkodzeniu komórki. Wykazano, że knockout czynnika recA biorącego udział w SOS pozwala znacznie zwiększyć działanie bakteriobójcze antybiotyków. Bakterie E. coli zakażono specjalnie zaprojektowanym bakteriofagiem powodującym nadekspresję represora SOS – lexA3. W kolejnym etapie zmodyfikowane bakterie inkubowano z antybiotykami należącymi do trzech klas: chinolonem (ofloksacyna), aminoglikozydem (gentamycyna), β-laktamem (ampicylina). Zaobserwowano zwiększoną aktywność bakteriobójczą – największa dla ofloksacyny, również dla populacji tworzącej biofilm.

Nowe możliwości walki z antybiotykoopornością dało odkrycie bakteryjnego systemu obrony przed wirusami – CRISPR-Cas, który polega na rozpoznaniu krótkich sekwencji obcego DNA przez bakterię, aby następnie został zdegradowany, uniemożliwiając ekspresję obcych genów w komórce gospodarza. Obecnie dzięki rozwojowi metod inżynierii genetycznej możliwe jest przygotowanie specjalnego bakteriofaga zawierającego geny CRISPR razem z genem, który ma zostać zdegradowany. Badania [6] dowiodły, że zastosowanie tej metody pozwala ponownie uwrażliwić bakterie na działanie antybiotyków oraz dzięki wprowadzeniu do systemu CRISPR kasety zawierającej fragmenty genów oporności na antybiotyki (np. β-laktamy), - uniemożliwić nabranie ponownej opornośc, jednocześnie nie ingerując w naturalny ekosystem pomiędzy niezmodyfikowanymi bakteriofagami a bakteriami. W innych badaniach [7] udało się wyeliminować oporność na antybiotyki w przypadku Staphylococcus aureus.

Bakterie probiotyczne mogą posłużyć jako żywe nośniki szczepionek przeciw drobnoustrojom chorobotwórczym. Dzięki modyfikacji genetycznej można w nich wzbudzić ekspresję antygenów, które wzbudzają odpowiedź immunologiczną gospodarza i zapewniają wytworzenie odporności.

Przykładem jest rekombinowana atenuowana szczepionka Salmonella (RASV) [1,8] zawierająca niektóre antygeny wirusowe, bakteryjne i pierwotniakowe zdolne do wytworzenie odpowiedzi immunologicznej i odporności organizmu przed przyszłymi zakażeniami. Dzięki zastosowaniu antygenów Mycobacterium tuberculosis udało się osiągnąć immunizację porównywalną z ochroną zapewnianą przez szczepionkę BCG (Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin). Inny przykład stanowią bakterie Lactobacillus casei oraz Lactobacillus lactis wzbogacone o geny pneumokokowego białka powierzchniowego C (PspC) oraz pneumokokowego białka ochronnego A (PppA), pozwalając na wytworzenie odpowiedzi immunologicznej i skuteczną ochronę przed zakażeniami pneumokokowymi u myszy.

Alternatywną bronią w walce ze szczepami antybiotykoopornymi, niezwiązaną z genowymi manipulacjami jest terapia fotodynamiczna (APDT) [9]. Takie podejście opiera się na zjawisku fotouczulania bakterii, przy wykorzystaniu egzogennych związków – fotosensybilizatorów (PS). Pod wpływem działania światła widzialnego o długości fali 400-700nm, związki te ulegają wzbudzeniu, biorąc udział w powstawaniu wolnych rodników tlenowych (ROS) w komórce bakteryjnej. Następnie bakteria na skutek uszkodzenia struktur komórkowych ulega śmierci. Powstawanie ROS na drodze terapii fotodynamicznej przebiega w dwóch mechanizmach, których udział zależy od zastosowanego PS. W typie I pod wpływem wzbudzonych PS, z tlenu cząsteczkowego powstaje anion nadtlenkowy, przechodzący następnie w bardziej toksyczne rodniki hydroksylowe czy nadtlenek wodoru. Natomiast w reakcji typu II w bezpośredniej reakcji wzbudzonego PS z tlenem powstaje reaktywny tlen singletowy.

W porównaniu z antybiotykami taka strategia ma kilka zalet m.in. nie ma tylko jednego celu w komórce, zabija bakteria w szybkim tempie, co uniemożliwia wytworzenie mechanizmów oporności, a także jest nieszkodliwa dla strefy nie poddanej leczeniu, ponieważ bez udziału światła stosowane związki nie są toksyczne.

Jako fotosensybilizatory stosowanych jest kilka grup związków [9]:

Pochodne fenotiazyny (w tym błękit metylenowy, róż bengalski czy błękit toluidyny) należą do pierwszej generacji PS. Obecnie są powszechnie stosowane zarówno w stosunku do bakterii Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych. Wykazano działanie tej grupy związków np. na Staphylococcus aureus (MSSA oraz MRSA) i Esherichia coli. W stosunku do tej drugiej zaobserwowano również działanie toksyczne bez udziału światła.

Zaobserwowano, że nowe pochodne błękitu metylenowego (nowy błękit metylenowy, niebieski dimetylan metylu czy zielony metylen) ze względu na większy ładunek dodatni są bardziej skuteczne jako fotosensybilizatory, ponieważ łatwiej łączą się z ujemnie naładowanymi strukturami komórki.

Pochodne fenotiazydu stanowią substrat dla pomp oporności wielolekowej – w celu zwiększenia skuteczności fototerapii należy stosować równocześnie inhibitory pomp (NorA, Mex-AB).

Efekt toksyczny nasila także azydek sodu – zaobserwowano zwiększone działanie bakteriobójcze podczas zastosowania światła czerwonego (620-750nm). Wykazano, że reakcja przebiega w mechanizmie typu I PS.

Porfiryny są grupą związków stosowanych w terapii fotodynamicznej, działających w mechanizmie typu II po wzbudzeniu światłem o długości fali 405-550nm. Skuteczność bakteriobójcza jest w tym przypadku proporcjonalna do liczby przenoszonych ładunków.

Porfiryny zawierające podstawniki pirydynowe (PYP) i imidazolowe (IMP), dzięki dodatniemu ładunkowi, wiążą się z błoną zewnętrzną poprzez oddziaływania jonowe i następnie przenikają przez ścianę komórkową do wnętrza bakterii. Trzeba również zauważyć, że porfiryny są pobierane przez komórki ssaków, co może zakłócać selektywność terapii fotodynamicznej.

Ftalocyjany - wzbudzane długością fali >660nm, stosowane w APDT, w większości oparte na cynku (II) wykazały skuteczność wobec bakterii E. coli, Streptococcus mitis, Pseudomonas aeruginosa.

Fulereny również pośredniczą w tworzeniu wolnych rodników na drodze reakcji fotochemicznych, jednak ze względu na budowę wymagają dodatkowych modyfikacji, aby możliwe było ich zastosowanie w stosunku do bakterii. Zmodyfikowana, kationowa forma (DTC602+) wykazuje działanie bakteriobójcze w stosunku do E. coli i P. aeruginosa. Natomiast inna forma (LC16) zabija Acinetobacter baumannii oraz S. aureus MRSA.

Hiperycyna – naturalnie występujący fotosensybilizator, składnik bioaktywny Dziurawca (Hypericum). Wykazuje działanie przeciwnowotworowe, przeciwwirusowe oraz przeciwbakteryjne. Wzbudzany światłem o długości 593nm. Hiperycyna wykazuje działanie w stosunku do S. aureus (MSSA i MRSA) oraz chorobotwórczych E. coli. Ponadto efekt bakteriobójczy był proporcjonalny do czasu inkubacji.

Kurkumina - kolejny naturalnie występujący fotosensybilizator, pochodzi z rośliny Curcuma longa. Pochłania światło o długości fali 405-435nm. Kurkumina wykazuje mocniejsze działanie w stosunku do bakterii Gram-dodatnich jak S. aureus niż Gram-ujemnych np. E. coli, Salmonella typhimurium.

Badania nad zastosowaniem terapii fotodynamicznej na kilku ważnych z epidemiologicznego punktu widzenia gatunkach bakterii są obiecujące. Wykazano m.in. skuteczność błękitu toluidyny, a także prekursora porfiryn – kwasu 5-aminolewulinowego (5-ALA) wobec Pseudomonas aeruginosa zarówno szczepu opornego, jak i wrażliwego na antybiotyki. W badaniach 5-ALA wykazuje selektywność wobec bakterii, pozostając nietoksyczny dla otaczających tkanek.

5-ALA jest także używany do badań nad zastosowaniem terapii fotodynamicznej w stosunku do Mycobacterium tuberculosis - bakterii, która ze względu na odmienną budowę stanowi większe wyzwanie dla APDT.

Innym przykładem zastosowania terapii jest Streptococcus mutans – bakteria bytująca w jamie ustnej, przez co łatwo dostępna dla APDT. Pozytywne wyniki uzyskano używając czerwieni bengalskiej, błękitu toluidyny, a zwłaszcza kurkuminoidów, które poza efektem bakteriobójczym wykazują także efekt ochronny przed kolonizacją płytki nazębnej.

Warte odnotowania jest zastosowanie terapii fotodynamicznej w celu eradykcji Helicobacter pylori. W tym przypadku nie jest wymagane stosowanie fotosensybilizatorów, ponieważ H. Pylori naturalnie syntezuje protoporfirynę oraz koproporfirynę. Badania kliniczne na grupie dziewięciu pacjentów potwierdziły skuteczność terapii z użyciem światła niebieskiego o długości fali 405nm dostarczonego za pomoce endoskopu – uzyskano 99% inaktywację bakterii.

Obiecujące wyniki uzyskano również w stosunku do Enterococcus faecalis oraz Staphylococcus aureus . Co ciekawe, w przypadku E. faecium zaobserwowano redukcję bakterii również podczas użycia samego naświetlania światłem czerwonym, sugerując produkcję w bakteriach związków światłoczułych. W stosunku do S. aureus MRSA w badaniach in vitro z zastosowaniem wielu związków (ftalocyjanów, porfiryn czy fenotiazydu) zaobserwowano zmniejszenie liczebności bakterii.

Opisane powyżej metody walki z bakteriami opornymi na obecnie dostępne antybiotyki są obiecujące. Mimo potrzeby dalszych badań nad klinicznym zastosowaniem, wydaje się, że proponowane metody są wstanie godnie zastąpić dotychczas stosowane standardowe leczenie. Metody skierowane na eliminację oporności bakterii bez ich eliminacji wydają się również ciekawą alternatywą, ponieważ dzięki temu uniknęlibyśmy zaburzenia ekosystemu. Należy jednak pamiętać, że bakterie są organizmami, które łatwo ulegają mutacjom. Nie jesteśmy wstanie zahamować rozwoju antybiotykooporności, lecz jedynie ją opóźnić. Jednak czy w przypadku metod opisywanych powyżej nie czeka nas podobna przyszłość? Niestety brak jest jednoznacznej odpowiedzi na to pytanie. W związku z tym pewne jest, że powinniśmy stosować racjonalnie zarówno obecnie stosowane metody leczenia, jak i te, które są w fazie badań, aby nie przyspieszyć rozwoju nowych mechanizmów obronnych bakterii.

Źródła

Literatura:

 

1. Hwang IY, Koh E, Kim HR et al. „Reprogrammable microbial cell-based therapeutics against antibiotic-resistant bacteria”. Drug Resist Updat. 2016 Jul;27:59-71. doi: 10.1016/j.drup.2016.06.002. Epub 2016 Jun 22.

 

2. Rutherford ST, Bassler BL. „Bacterial quorum sensing: its role in virulence and possibilities for its control”. Cold Spring Harb Perspect Med. 2012 Nov 1;2(11). pii: a012427. doi: 10.1101/cshperspect.a012427.

 

3. Kohanski MA, Dwyer DJ, Hayete B et al. „A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics”. Cell. 2007 Sep 7;130(5):797-810.

 

4. Lu TK, Collins JJ. „Engineered bacteriophage targeting gene networks as adjuvants for antibiotic therapy”.Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Mar 24;106(12):4629-34. doi: 10.1073/pnas.0800442106.

 

5. Nobrega FL, Costa AR, Kluskens LD et. al. „Revisiting phage therapy: new applications for old resources”. Trends Microbiol. 2015 Apr;23(4):185-91. doi: 10.1016/j.tim.2015.01.006.

 

6. Yosef I, Manor M, Kiro R et. al. „Temperate and lytic bacteriophages programmed to sensitize and kill antibiotic-resistant bacteria”. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Jun 9;112(23):7267-72. doi: 10.1073/pnas.1500107112.

 

7. Bikard D, Euler CW, Jiang W et. al. „Exploiting CRISPR-Cas nucleases to produce sequence-specific antimicrobials”. Nat Biotechnol. 2014 Nov;32(11):1146-50. doi: 10.1038/nbt.3043.

 

8. Wang S, Kong Q, Curtiss R 3rd. „New technologies in developing recombinant attenuated Salmonella vaccine vectors”. Microb Pathog. 2013 May;58:17-28. doi: 10.1016/j.micpath.2012.10.006.

 

9. Yao Liu, Rong Qin, Sebastian A. J. Zaat et al.”Antibacterial photodynamic therapy: overview of a promising approach to fight antibiotic-resistant bacterial infections” , J Clin Transl Res, 2015; 1(3): 140-167

 

grafika:

 

https://pixabay.com/pl/uzale%C5%BCnienie-antybiotyk-kapsu%C5%82ka-71538/

 

https://selfhacked.com/2016/03/11/all-about-quorum-sensing-and-natural-quorum-sensing-inhibitors/

 

https://www.nap.edu/read/13239/chapter/2#71

 

http://www.biotechniques.com/news/CRISPR-Gets-a-Little-Crisper/biotechniques-345799.html#.WCjtlB9EnQo

 

http://www.mdpi.com/2072-6694/3/2/2516/htm

 

http://www.internetchemie.info/news/2009/oct09/photodynamic-therapy.html

KOMENTARZE
news

<Sierpień 2019>

pnwtśrczptsbnd
29
30
31
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
1
Newsletter