Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Konduktywny film DNA użyty w biosensorze nadtlenku wodoru
05.12.2007
Wysoka specyficzność i dokładność działania elektrochemicznych biosensorów warunkowana jest poprawnie przeprowadzoną immobilizacją enzymu na powierzchni elektrody pracującej. Z dwóch powodów, proces unieruchamiania biokatalizatora jest kluczowym etapem konstrukcji urządzenia. Po pierwsze sposób immobilizacji enzymu bezpośrednio przekłada się na jego aktywność i stabilność. Po drugie matryca w której unieruchamiany jest enzym spełnia rolę jedynego szlaku po którym poruszają się elektrony w kierunku: od/(do) centrum katalitycznego enzymu do/(od) powierzchni elektrody. Starając się zoptymalizować działanie biosensorów, naukowcy wykorzystują coraz nowsze procedury immobilizacji enzymów z wykorzystaniem takich materiałów (matryc łącznikowych) jak: lipidy, biopolimery chitozanu, funkcjonalne nanomateriały czy molekuły DNA. Niedawno chińscy naukowcy skonstruowali biosensor do pomiarów nadtlenku wodoru, w którym enzym – peroksydaza chrzanowa (HRP) „kontaktuje się” z elektrodą za pośrednictwem warstwy DNA. Ponieważ cząsteczki kwasu deoksorybonukleinowego to negatywnie naładowane polielektrolity, mogą one łatwo tworzyć polianionowe kompleksy z dodatnio naładowanymi poliaminami. Z kolei taki polianionowy kompleks, to układ komplementarnie sparowanych zasad azotowych wzdłuż podwójnej nici DNA mogących służyć jako system połączonych „pi” elektronów, który umożliwia transfer ładunku na odległość do 40 angstremów. Za hipotezą takiego przewodnika elektronowego przemawiają obliczenia energii orbitalnych zasad purynowych (adenina i guanina) i pirymidynowych (cytozyna, tymina) w cząsteczce DNA. Energie najwyższego zapełnionego orbitalu (HOMO) i najniższego nie zapełnionego orbitalu (LUMO) mogą stanowić miarę potencjału jonizacji i powinowactwa elektronowego. Z tego względu odgrywają one bardzo istotną rolę w rozpatrywaniu oddziaływań donorowo-akceptorowych zasad azotowych w DNA. I tak najsilniejszym donorem elektronów okazuje się być guanina (HOMO a+0.31b; LUMO a-1.05b), a najsilniejszym akceptorem – cytozyna (HOMO a+0,60b; LUMO a-0.80b). Przy czym oddziaływanie w obrębie pary G-C nie wpływa silnie na energie orbitalne, dlatego też para G-C jest jednocześnie najlepszym donorem i najlepszym akceptorem elektronów. Drugą możliwością transportu elektronów za pośrednictwem DNA jest wykorzystanie szkieletu cukrowo-fosforanowego biomolekuły. Polianionowy kompleks DNA służy jako matryca, w której pomiędzy zasady azotowe podwójnej nici DNA dostają się specjalne interkalatory redoks, a w której transport ładunku zachodzi na sposób przemieszczania się zasocjowanych jonów względem ujemnie naładowanego szkieletu cukrowo-fosforanowego molekuły (przewodnik jonowy). Grupa naukowców kierowana przez Yanga S.Q. skonstruowała biosensor, w którym elektropolimeryzowano tioninę (3,6-diaminofenotiazyna) na powierzchni elektrody pracującej uzyskując warstwę politioniny (PTH), - czyli de facto poliaminy. Następnie utworzono polijonowy kompleks poprzez dodanie polianionowych cząsteczek DNA i dodatnio naładowanych nanocząstek srebra. Z kolei do nanocząstek srebra związano peroksydazę chrzanową (HRP) poprzez wiązania kowalencyjne pomiędzy resztami cysteiny-SH lub lizyny-NH3+ enzymu a koloidalną powierzchnią srebra. W ten sposób uzyskano elektrodę węglową GCE, pokrytą specjalnym filmem DNA (polijonowy kompleks: PTH/DNA/nanosrebro), na której immobilizowano enzym HRP. Dla porównania autorzy pracy skonstruowali również modyfikacje wyżej wymienionego układu (GCE/PTH/DNA/nanosrebro/HRP): pierwszy przypadek z pominięciem warstwy DNA – GCE/PTH/nanosrebro/HRP, natomiast drugi z pominięciem warstwy politioniny PTH –GCE/DNA/nanosrebro/HRP. Rezultaty zastosowanej cyklowoltametrii (natężenie wynikowe funkcją przykładanego napięcia) pokazały, że zdecydowanie najlepszą odpowiedzią cechował się układ pierwotny, natomiast zdecydowanie gorszą układ pozbawiony bądź to DNA lub PTH. W przypadku gdy na powierzchni elektrody nie było DNA lub PTH, obserwowano znacznie niższe piki pochodzące od quasiodwracalnych procesów elektrodowych, co świadczy o dużym zmniejszeniu wydajności transferu elektronów na drodze elektroda-enzym. Dzieje się tak ze względu na bardzo zabudowane centrum katalityczne peroksydazy chrzanowej, której trudno jest wymienić elektrony z elektrodą (dlatego też pomaga jej w tym specjalny film DNA). Chińscy naukowcy zastosowali biosensor o składzie elektroda pracująca: GCE/PTH/DNA/nanosrebro/HRP, kalomelowa elektroda odniesienia i elektroda zliczająca do oznaczeń stężenia nadtlenku wodoru w analicie. Zasada działania urządzenia: peroksydaza chrzanowa (HRP-[Fe3+ <->Fe2+]) katalizuje utlenienie PTH(red.) do PTH(ox.) zużywając stechiometrycznie nadtlenek wodoru (redukując go do wody). Sprzężony układ reakcji redoks podtrzymywany jest dzięki regeneracji PTH(ox.), poprzez redukcję PTH(red.) na powierzchni elektrody (wymagane napięcie -0,3V vs Hg/Hg2Cl). Wzrost natężenia w układzie pozostaje proporcjonalny w stosunku do zużywanego H2O2, dla zakresu stężeń nadtlenku wodoru od 1.1 x 10-6 M do 5.2 mM.


Microchimica Acta (2007), “Amplification of bioelectrocatalytic signalling based on silver nanoparticles and DNA-derived horseradish peroxidase biosensors
KOMENTARZE
news

<Kwiecień 2025>

pnwtśrczptsbnd
31
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
1
2
3
4
Newsletter