Biotechnologia.pl: Z informacji dostępnych na stronie internetowej Instytutu Nenckiego wiemy, że wybór modelu komórkowego, na którym Państwo pracują jest nieprzypadkowy, czy mogłaby Pani po krótce opowiedzieć o początkach Pani pracy związanej z działaniem metotreksatu na komórki raka jelita grubego?

Dr hab. Magdalena Dąbrowska: Modelem badawczym jest linia komórkowa raka jelita grubego wyprowadzona z guza pacjenta, u którego zdiagnozowano postać choroby nowotworowej z dystalnymi przerzutami (stadium D w/g klasyfikacji Duke'a). Głównie po interwencji chirurgicznej, w leczeniu raka jelita grubego stosowany jest zazwyczaj prekursor inhibitora syntazy tymidylanowej, 5-fluorouracyl (5-FU) w kombinacji z innymi lekami. Inhibitorem syntazy tymidylanowej jest również metotreksat, jednak reduktaza dihydrofolianowa ze względu na wysokie powinowactwo do tego leku pozostaje jego głównym wewnątrzkomórkowym efektorem. Z badań klinicznych wiadomo, że nowotwory jelita grubego są specyficznie oporne na działanie metotreksatu. Moim pierwszym celem było sprawdzenie możliwości obrazowania działania metotreksatu na hodowane in vitro komórki raka jelita grubego, przy założeniu indukcji translacji białka reduktazy dihydrofolianowej. Chciałabym wyjaśnić, że metotreksat jest analogiem naturalnego substratu reduktazy dihydrofolianowej, kwasu dihydrofoliowego, ulegającego redukcji do tetrahydrofolianu w reakcji katalizowanej przez ten enzym. Struktura metotreksatu została zaprojektowana w oparciu o modyfikacje pierścieni pterydynowego i p-aminobenzoesowego dihydrofolianu. Skonstruowaliśmy zatem pochodną linię komórkową, w której translacja mRNA białka reporterowego podlegała kontroli przez elementy sekwencji zidentyfikowane jako odpowiedzialne za wywołany przez metotreksat wzrost poziomu białka reduktazy dihydrofolianowej, obserwowany między innymi dla komórek raka jelita grubego linii HCT-8 i HCT-116.

W jaki sposób zamierzali Państwo monitorować oczekiwane zmiany?

Jako reporter wykorzystaliśmy białko zielonej fluorescencji (EGFP). Oznaczaliśmy zatem wywołane przez metotreksat zmiany fluorescencji EGFP w żywych komórkach. Zgodnie z oczekiwaniami, działanie metotreksatu spowodowało wzrost fluorescencji EGFP, jednakże wbrew założeniom, nie towarzyszyła temu zmiana poziomu białka ani EGFP, ani reduktazy dihydrofolianowej. Wynikało z tego, że to nie wzrost ekspresji reduktazy dihydrofolianowej stanowi o braku wrażliwości badanej linii komórkowej na metotreksat. Obserwowany wzrost fluorescencji EGFP, jak i autofluorescencji, świadczył o zmianach parametrów spektralnych komórek.

Skoro nie ma związku między działaniem metotreksatu, a zmianami ekspresji białka reduktazy dihydrofolianowej rozumiem, że postanowili Państwo poszukać innych składowych mechanizmu działania tego leku na komórki raka jelita gubego?

Zaobserwowane zmiany morfologii, jak i parametrów spektralnych, wskazywały na to, że w badanej linii komórek raka jelita grubego metotreksat indukuje fenotyp starzenia komórkowego. Potwierdziliśmy to oznaczając odpowiednie markery molekularne. Było to pierwsze doniesienie o indukcji starzenia wywołanego przez metotreksat w komórkach nowotworowych tego typu. Wiadomo było, że w limfocytach oraz komórkach nowotworowych różnego rodzaju, w tym głównie białaczkowych, metotreksat indukuje apoptozę. Lek ten może również wykazywać działanie cytostatyczne. Starzenie komórkowe to nic innego jak trwałe zatrzymanie wzrostu komórki. Forma starzenia wywołana przez różne warunki stresowe, prowadzące do indukcji uszkodzeń DNA, określana jest jako starzenie przyspieszone. Zarówno chemioterapia jak i radioterapia mogą indukować przyspieszone starzenie w komórkach nowotworowych, które określane jest wówczas także jako starzenie indukowane terapią. Jednakże, dla niektórych linii komórek nowotworowych stan starzenia nie jest stanem terminalnym. Dotyczy to również badanych przeze mnie komórek raka jelita grubego, które po usunięciu metotreksatu z pożywki hodowlanej odnawiają się jako linia potomna. Zjawisko takie, znane z literatury, polega na tym, że komórki będące w fazie starzenia, w wyniku asymetrycznych podziałów produkują tak zwane żywe genomy, dające początek normalnie rosnącej potomnej linii komórkowej. Mechanizm ten zapewnia utrzymanie ciągłości danej linii, a tak odnowioną linię charakteryzuje wysoki potencjał proliferacyjny, akumulacja aberracji genomowych oraz większa oporność na ewentualną terapię. Procesem towarzyszącym stanowi starzenia i warunkującym przetrwanie nowotworu w formie uśpionej, jest autofagia, czyli wewnątrzkomórkowy recykling makromolekuł. Analiza profilu ekspresji genów w badanych komórkach raka jelita grubego wprowadzonych w starzenie w wyniku działania metotreksatu, wykazała indukcję ekspresji szeregu genów zaangażowanych w egzekucję właśnie autofagii.

Czy udało się Państwu zidentyfikować konkretne szlaki sygnałowe regulujące wywołane przez metotreksat starzenie komórek raka jelita grubego?

Przy użyciu mikromacierzy ekspresyjnych wykonaliśmy systemową analizę profilu ekspresji genów w tym układzie biologicznym. Progresja komórek raka jelita grubego w starzenie wywołane przez metotreksat, wydaje się podlegać regulacji zależnej od białka p53, co nie stanowi specjalnego zaskoczenia ponieważ p53, określane jako strażnik genomu, odgrywa istotna rolę w odpowiedzi komórki na stres genotoksyczny. Aktualnie analizujemy wzór modyfikacji post-translacyjnych tego białka, aby wyjaśnić podłoże zróżnicowanej wewnątrzkomórkowej sygnalizacji zależnej od p53, która ostatecznie decyduje o losach komórki. W komórkach raka jelita grubego będących w fazie starzenia stwierdziliśmy bowiem wzrost ekspresji genów zależnych od p53, a regulujących zarówno apoptozę, jak i starzenie, autofagię, naprawę DNA i oddziaływania międzykomórkowe. Jako główny czynnik koordynujący wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe w fazie utrzymywania starzenia, zidentyfikowaliśmy stres oksydacyjny. Dla tej fazy charakterystyczna jest także ekspresja genów związanych ze stanem zapalnym, w tym kinaz białkowych p38 MAPK β i AKT, czynnika transkrypcyjnego NF-κB oraz interleukiny 1, szeregu chemokin i indukowanej formy syntazy tlenku azotu iNOS.

Czy dawki metotreksatu stosowane przez Panią w badaniach in vitro maja jakieś przełożenie na te, stosowane w klinice?

Stosuję stężenie 1-mikromolowe. Jest to stężenie metotreksatu, które utrzymuje się we krwi pacjentów po 48 godz. od podania wysokiej dawki leku. Jednocześnie, jest to także stężenie wymagane do efektywnego zahamowania aktywności reduktazy dihydrofolianowej w komórce, pomimo stałej inhibitorowej dla oczyszczonego enzymu utrzymującej w zakresie stężeń pikomolowych. W stosunku do badanych komórek raka jelita grubego IC₅₀ dla metotreksatu wynosi 50nM. Dawki leku powyżej IC₅₀ prowadzą do indukcji starzenia, jako jednolitego typu odpowiedzi pomimo tego, że komórki te są również zdolne do wejścia w apoptozę.

W komórkach białaczkowych metotreksat prowadzi do indukcji uszkodzeń DNA i apoptozy, co wynika z zahamowania aktywności reduktazy dihydrofolianowej. Jakie są inne, ważne konsekwencje zahamowania aktywności tego enzymu?

W komórkach białaczkowych, ale także w komórkach innego typu, np.: keratynocytach, wywołana przez metotreksat apoptoza spowodowana jest produkcją wolnych rodników tlenowych uszkadzających DNA. Oprócz zatem zaburzenia puli nukleotydów metotreksat indukuje także stres oksydacyjny. Ponadto wiadomo, że zahamowanie przez metotreksat aktywności reduktazy dihydrofolianowej w komórkach sródbłonka naczyń prowadzi do zakłócenia sygnalizacji przez tlenek azotu. W komórkach endotelium enzym ten jest bowiem odpowiedzialny za regenerację kofaktora syntazy tlenku azotu, tetrahydrobiopteryny. Warto również wspomnieć o tym, że starzenie endotelium związane jest ze spadkiem aktywności endotelialnej formy syntazy tlenku azotu i następującym w warunkach spadku stężenia tlenku azotu, wzrostem ekspresji innej, tj. indukowanej isoformy tego enzymu. Wiadomo, że wszystkie isoformy syntaz tlenku azotu w warunkach niedoboru tetrahydrobiopteryny mają zdolność syntezy zamiast tlenku azotu, anionorodnika ponadtlenkowego. Właśnie to zjawisko, określane jako rozprzężenie aktywności syntazy tlenku azotu, zachodzi w komórkach endotelium poddanych działaniu metotreksatu. W badanych przez nas komórkach raka jelita grubego stwierdziliśmy ekspresję na poziomie mRNA endotelialnej formy syntazy tlenku azotu. Ponadto, w trakcie progresji w starzenie wywołane przez metotreksat dochodzi w tych komórkach do spadku ekspresji endotelialnej, a do wzrostu ekspresji indukowanej formy syntazy tlenku azotu. Wyniki te wydają się zatem wskazywać na to, że mechanizm cytostatycznego działania metotreksatu może w tym przypadku polegać na zakłóceniu sygnalizacji przez tlenek azotu i wywołaniu stresu oksydacyjnego przez rozprzężenie aktywności syntazy tlenku azotu. Inne badania wykazały, że w komórkach raka jelita grubego oraz w nabłonku jelita grubego, może zachodzić sygnalizacja przez tlenek azotu. Sugeruje to zatem, że proponowany przez nas mechanizm działania metotreksatu na komórki raka jelita grubego, ma szersze odniesienie.

Dlatego uważają państwo, że indukcja przez metotreksat przyspieszonego starzenia w komórkach raka jelita grubego wynikałaby z zachwiania równowagi redoks?

Stres oksydacyjny jest ogólnie uznany za główny czynnik sprawczy utrzymywania komórek w stanie starzenia. Nasze badania mają teraz na celu weryfikację hipotezy o roli syntaz tlenku azotu w tym procesie, w odniesieniu do komórek raka jelita grubego wprowadzonych w starzenie przez metotreksat. Jeśli metotreksat pozostaje w komórkach starych związany z reduktazą dihydrofolianową, na co także wskazują nasze wyniki, i jeśli konsekwencją tego jest ciągła generacja stresu oksydacyjnego, to taki mechanizm mógłby wskazywać na rolę syntaz tlenku azotu w obserwowanej niewrażliwości raka jelita grubego na ten lek. Przypomnieć tu należy o zdolności komórek starych do odtworzenia linii potomnej po usunięciu metotreksatu ze środowiska.

Życzymy dalszych sukcesów w realizacji pracy naukowo – badawczej.

Wywiad przeprowadziła dr Marzena Szwed, redaktor naukowy portalu Biotechnologia.pl