W jednym ze zrealizowa­nych projektów badawczych porównaliśmy dwie meto­dy pozwalające na pomiar temperatury topnienia (Tm) monoklonalnych przeciwciał terapeutycznych (mAb): na­noDSF (nano-differential scanning fluorimetry) – mierząca zmiany emisji fluorescencji białka w roztworze, na skutek jego denaturacji, oraz μDSC (differential scanning calorime­try), która wykrywa zmiany w pojemności cieplnej roztwo­ru białka, będącej konsekwencją jego denaturacji. Zarówno nanoDSF i μDSC dostarczy­ły precyzyjnych i spójnych wyników eksperymental­nych. NanoDSF jednocześ­nie wyklucza wiele ograni­czeń μDSC, takich jak niska przepustowość i wysoka zu­żywalność próbki. W związ­ku z tym stanowi doskona­łą alternatywę w projektach, gdzie szybkość i precyzja po­miaru jest istotna, przy jed­noczesnej oszczędności cza­su i zużycia preparatu.

W innym projekcie ba­dawczym zademonstrowali­śmy, że nanoDSF może być z sukcesem wykorzystywane do przewidywania stabilno­ści długoterminowej w prze­ciągu zaledwie kilku godzin trwania eksperymentu. Prze­prowadzone badania polega­ły na analizie zarówno termicznej, jak i chemicznej, stabil­ności białek w układzie wysokoprzepustowym. Korzystając z modelu Prometheus NT.Plex z przystawką do optycznej analizy agregacji (AGO), przebadaliśmy pięć różnych formu­lacji, dla różnych przeciwciał monoklonalnych, w różnych stężeniach, oceniając ich stabilność termiczną i chemiczną. Otrzymane wyniki denaturacji korelowały z długotermino­wą analizą zmętniania (turbidity assay) i pomiarem zawarto­ści formy monomerycznej w czasie, pokazując, że Promethe­us NT.Plex dostarcza informacji na temat długoterminowej stabilności białek w przeciągu zaledwie jednego dnia pracy.

Nowatorskie podejście do istniejących problemów

Stabilność termiczna białka jest rutynowo wykorzystywanym parametrem do przewidzenia fizycznej trwałości preparatu, który wpływa znacząco na jego czas życia w danej formulacji. Historycznie μDSC było metodą pierwszego wyboru w firmach biofarmaceutycznych, w rozwoju formulacji preparatów białkowych. Jakkolwiek metoda ta jest uznawana za złoty standard w pomiarach stabilności białek, μDSC ma wiele ograniczeń. Technika ta wymaga drobiazgowego równoważenia i kalibracji, które wykluczają możliwość jednoczesnych pomiarów różnych próbek, wymuszając na naukowcach pomiary pojedyncze. Co więcej, zakres stężeń dla przeciwciał jest możliwy do zbadania w zakresie od 0,5 do 5 mg/ml. Dodatkowo wymagana objętość próbki to kilkaset mikrolitrów, co w przypadku długich procesów związanych z testowaniem różnych warunków staje się uciążliwe w trakcie wysokoprzepustowego badania formulacji. Dlatego też preselekcja warunków jest często niezbędna. W laboratoriach zajmujących się projektami wysokoprzepustowymi, m.in. badającymi różne formulacje produktów białkowych, oraz tam, gdzie liczba próbek jest bardzo duża, naukowcy poszukują rozwiązań technologicznych, które pozwolą na zwiększenie skali, skrócenie czasu dostarczenia wyniku, a także jednoczesną optymalizację kosztów. Urządzenie z serii Prometheus uzupełnia wspomniane wcześniej luki w badaniu denaturacji białka za pomocą bardzo precyzyjnej analizy zmiany wewnętrznej fluorescencji w strukturze cząsteczki. Nasza technologia nie wymaga wcześniejszego znakowania badanej cząsteczki białka. W związku z tym, zachodzące procesy dostarczają informacji bezpośrednio pochodzącej od samej cząsteczki, a nie sygnału będącego skutkiem detekcji znacznika. Prometheus pozwala na równoczesną analizę do 48 niezależnych próbek w zakresie stężeń od 10 μg/ml do powyżej 250 mg/ml, bez konieczności modyfikacji buforu, w którym znajduje się badane białko. Brak znacznika fluorescencyjnego, jaki jest konieczny w przypadku klasycznej techniki DSF, wyklucza jego potencjalny negatywny wypływ na strukturę białka, czy układu buforującego, przez co nanoDSF unika artefaktów eksperymentalnych. W urządzeniu Prometheus zastosowaliśmy innowacyjny system detekcji – zespolony dual-uv, który pozwala na szybkie mierzenie próbki w czasie, co w konsekwencji zapewnia wysoką gęstość punktów pomiarowych na jednostkę °C w trakcie gradientu temperatury.

Przykładowe badania porównawcze
W celu porównania precyzji i jakości wyników pomiaru temperatury topnienia białek (Tm) przy pomocy μDSC i nanoDSF, przeprowadziliśmy badanie różnych formulacji dla jednego z terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych (mAb). Przebadaliśmy dziesięć różnych warunków w buforach i zakresach pH. Zastosowaliśmy również dwa, często wykorzystywane przy formulacji przeciwciał, surfaktanty PS20 i PS80, o których wiadomo, że uniemożliwiają wykorzystanie innych klasycznych metod, takich jak DSF. W wyniku eksperymentów wykazaliśmy, że zarówno nanoDSF, jak i μDSC dostarczają precyzyjnych i zbliżonych danych w zakresie pomiaru Tm (Rycina 1.A i B). Jednocześnie nanoDSF wymagała zdecydowanie mniejszego nakładu ilości próbki oraz czasu na uzyskanie wyników, w porównaniu do μDSC (Rycina 1.C).

Zintegrowany protokół nanoDSF i innowacyjny system dostarczania próbek, z wykorzystaniem szklanych, cienkościennych kapilar w urządzeniach serii Prometheus rozwiązują wiele kluczowych problemów, znanych z μDSC (Rycina 1.D). Nasza technologia pozwala na wygodną pracę z próbką, nawet w przypadku kiedy mamy do czynienia z bardzo wysokim stężeniem i lepkością roztworu (>cP). nanoDSF charakteryzuje się doskonałą precyzją, szybkością i przepustowością, jak również solidnością zastosowanych materiałów i ich konstrukcji. Co więcej, sposób prowadzenia eksperymentów nie wymaga dużego nakładu czasu na jego przygotowania oraz – zwykle kłopotliwych – procesów serwisowych i kalibracji, a także nakładu czasu na przygotowanie do eksperymentu (filtracja czy dializa).

W drugim projekcie przeprowadziliśmy analizę proof-of-concept dla chemicznej i termicznej denaturacji lizozymu, który jest bardzo dobrze poznanym białkiem, m.in. w zakresie charakterystyki przebiegu jego agregacji. Przeanalizowaliśmy wartość ΔG°agg, temperaturę punktu początkowego agregacji (aggregation onset temperature – Tagg) oraz temperatury topnienia dla przeciwciał w wielu różnych formulacjach (Tm) i porównaliśmy uzyskane dane z pomiarami zmętnienia i zawartości formy monomerycznej w czasie, zgodnie z wynikami uzyskanymi przy pomocy HPSEC (High Pressure Size Exclusion Chromatography) dla długoterminowej analizy stabilności. W tym celu wykorzystaliśmy naszą zautomatyzowaną stację pipetującą – NT.Robotic Autosampler oraz urządzenie z serii Ptometheus – model NT.Plex. Uzyskane dane pozwoliły na zidentyfikowanie najlepszych warunków formulacji preparatu i długoterminowej stabilności białka.

Wyniki badań udowodniły, że eksperymenty z wykorzystaniem chemicznej denaturacji białek na urządzeniach serii Prometheus są skuteczną metodą przewidywania długoterminowej stabilności koloidalnej leków biologicznych. Jednocześnie zmiany w wartości ΔG°, w zależności od stężenia białka, dostarczają informacji w zakresie potencjalnie zachodzącej agregacji badanej cząsteczki białka. Co więcej, zastosowanie technologii nanoDSF pozwala na rozróżnienie pomiędzy agregacją natywną, jako cechą białka, a agregacją na skutek denaturacji w danych warunkach w roztworze. Świadomość zachodzenia i mechanizmu agregacji badanego białka jest jedną z kluczowych informacji, niezbędnych w procesie rozwoju leku biologicznego, a także w pracach na etapie wczesnego rozwoju projektu naukowego (np. na etapie produkcji i oczyszczania białek).
Prometheus – unikalna elastyczność i precyzja w krótszym czasie

Podsumowując, wykazaliśmy, że nasze urządzenie Prometheus NT.Plex zapewnia unikalną elastyczność eksperymentalną i jest prostym w użyciu sprzętem laboratoryjnym, który służy do kompleksowej charakteryzacji chemicznej (ΔG°), termicznej (Tms i Tm onsets) i stabilności koloidalnej (Tagg i stopień zagregowania) białek w roztworze i potencjalnych leków biologicznych. Nasze urządzenia charakteryzują się budową modułową, dając badaczom możliwość rozbudowy sprzętu wraz ze wzrostem jego wykorzystania w procesach eksperymentalnych. Składają się z: głównego urządzenia Prometheus NT.Plex, NT.Robotic Autosampler oraz dowolnej stacji pipetującej. Tak skomponowane moduły pozwalają na wysokoprzepustową analizę chemiczną i termiczną denaturacji białek wraz z odpowiednim czasem inkubacji pomiędzy cyklami pomiarowymi. Układ Prometheus NT.Plex pozwala na osiągnięcie maksymalnej elastyczności i oszczędności czasu, ponieważ nie wymaga przygotowywania próbki każdorazowo, kiedy urządzenie nie wykonuje innego pomiaru. Zastosowanie dedykowanej automatyki (NT.Robotic Autosampler) zapewnia bardzo długi czas bezobsługowy, przez co maksymalizuje liczbę pomiarów, przy jednoczesnej minimalizacji czasu pracy badaczy.

Powyższe cechy pozwalają określić urządzenie Prometheus NT.Plex jako unikalne i wartościowe narzędzie w kompleksowej analizie białek i leków biologicznych w zakresie ich stabilności i właściwości agregacyjnych.

Nasza technologia charakteryzuje się również wysoką uniwersalnością w zakresie dostosowywania do istniejącej bazy sprzętowej. W laboratorium, gdzie zainstalowana jest już stacja pipetująca, Prometheus NT.Plex może być zintegrowany z dowolną platformą. W pełni zautomatyzowane urządzenie NT.Plex pozwala na analizę nieograniczonej liczby próbek, bez nadzoru użytkownika oraz na brak przestojów w pracy, bez górnego limitu wykonanych cykli eksperymentalnych.

NanoTemper Technologies dostarcza własne rozwiązania w zakresie oprogramowania, pozwalające na złożoną analizę wyników we wszystkich zastosowaniach technologii nanoDSF.
 

Autor: dr Piotr Wardęga
Senior Application Specialist & Team Leader Sales, NanoTemper Technologies sp. z o.o.