Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Transformacja roślin za pomocą bakterii z rodzaju Agrobacterium – powtórka przed sesją
Transformacja roślin za pomocą bakterii z rodzaju Agrobacterium – powtórka przed sesją
Wykorzystanie naturalnych procesów zachodzących w przyrodzie w celu realizacji projektów naukowych to dobra i skuteczna metoda zwiększania użyteczności roślin i tworzenie roślin transgenicznych. Bardzo wiele technik powszechnie stosowanych w laboratorium zostało opracowane na podstawie naturalnych procesów występujących w naturze. Nawet w przypadku tak „medialnie wynaturzonego” procesu, jakim jest tworzenie organizmów modyfikowanych genetycznie inspiracją dla naukowców były zjawiska powszechnie występujące w przyrodzie.

Agrobacterium to rodzaj bakterii należących do gram-ujemnych pałeczek. Są one przyczyną występowania chorób u roślin, stąd nazywane są często bakteriami fitopatogennymi oraz odpowiadają za horyzontalny transfer genów. Obecnie naturalne zdolności Agrobacterium wykorzystuje się w laboratoriach, gdzie służą jako narzędzie w inżynierii genetycznej. Pozwala to na tworzenie roślin o ulepszonych właściwościach agrotechnologicznych lub konsumpcyjnych.

 

Powszechnie używane są dwa gatunki bakterii z rodzaju Agrobacterium zdolnych do wnikania do wnętrza komórek  roślinnych poprzez zranione tkanki. Należą do nich:

 

Agrobacterium tumefaciens - zakażenie rośliny objawia się powstawaniem guzowatych narośli, zwanych również tumorami (ang. tumor inducing).

 

Agrobacterium rhizogenes - w miejscu infekcji powstaje obfita ilość tzw. korzeni włośnikowych (ang. root inducing).

 

Bakterie z rodzaju Agrobacterium zaliczane są do rodziny Rhizobiaceae, czyli do tej samej do której należą bakterie symbiotyczne roślin motylkowych - rizobia.

 

Unikalną cechą Agrobacterium jest zdolność do przekazania gospodarzowi plazmidu, który ingeruje w jego genom. U A. tumefaciens wyróżnia się plazmid Ti, zaś u A. rhizogenes plazmid Ri. Każdy z nich zawiera fragment zwany T-DNA (ang. transfer DNA), w którym zawarte są geny przekazywane komórkom roślinnym. Wielkość plazmidu jest stosunkowo duża bo zwykle ok. 200 tys. p. z. U szczepów dzikich plazmid ten w obrębie T-DNA zawiera geny kodujące opiny otoczone sekwencjami granicznymi oraz onkogeny. Dodatkowo poza regionem T-DNA na plazmidzie Agrobacterium występuje region genów wirulencji oraz geny katabolizmu opin.

 

Do komórek roślin przenoszony jest fragment T-DNA wraz z sekwencjami granicznymi o długości 20 tys. p. z. Oprócz objawów chorobowych fragment ten wpływa na syntezę metabolitów wtórnych - opin. Nie są one przyswajane przez rośliny, a stanowią doskonałą pożywkę dla bakterii. Geny katabolizmu opin znajdują się na plazmidzie, jednak nie są przekazywane do komórek roślinnych.

 

Praktyczne badania laboratoryjne dowiodły, że zastąpienie onkogenów oraz genów syntezy opin dowolnym genem, przy jednoczesnym zachowaniu sekwencji granicznych, nie ma wpływu na efektywność przekazania genów z bakterii do rośliny. Odkrycie to stanowiło kamień milowy i przełom w badaniach nad roślinami transgenicznymi.

 

W praktyce laboratoryjnej, z wielu technicznych powodów zrezygnowano z prac nad naturalnie występującym u Agrobacterium plazmidem. Na jego bazie skonstruowano nowy, mały plazmid, replikowany zarówno w Agrobacterium jak i Escherichai coli. Nazwany został on plazmidem binarnym. Dzięki temu, praca z nim w warunkach laboratoryjnych stała się prostsza i bardziej wydajna, przy jednoczesnym zachowaniu naturalnego schematu transformacji występującego u dzikich szczepów Agrobacterium.

 

U wykorzystywanych do transformacji roślin Agrobacterium, oprócz zmodyfikowanego, małego plazmidu binarnego, znajduje się megaplazmid pozbawiony T-DNA. Jest on niezbędny ponieważ koduje wymagane do infekcji geny wirulencji. Ich głównymi zadaniami są: aktywacja pozostałych czynników wirulencji w obecności substancji wskazujących obecność zranionych roślin, wytworzenie struktur pozwalających na przeniesienie T-DNA, wycięcie T-DNA i opłaszczenie pozwalające na wydajny transport materiału genetycznego do jądra komórki roślinnej.

 

Proces transgenezy komórek roślinnych z wykorzystaniem Agrobacterium można podzielić na 6 etapów:

1.       Wprowadzenie odpowiedniego fragmentu DNA do wektora binarnego, transformacja komórek bakteryjnych oraz namnożenie odpowiedniej ilości transgenicznych bakterii.

2.       Zainfekowanie komórek roślinnych poprzez bakterie i przekazanie zmodyfikowanego fragmentu T-DNA. Ten etap można przeprowadzić na drodze koinkubacji (inkubacja fragmentów roślin z bakteriami, czas - od kilku minut do kilku godzin) lub na drodze kokultury (eksplantaty roślin na pożywce regenracyjnej rosną wraz z hodowlą Agrobacterium).

3.       Eliminacja Agrobacterium np. poprzez wykorzystanie antybiotyków oraz wyselekcjonowanie pozytywnych mutantów roślin poprzez zastosowanie czynnika selekcyjnego np. herbicydu.

4.       Ukorzenienie transformowanych roślin.

5.       Sprawdzenie poprawności procesu transformacji.

6.       Przystosowanie zmodyfikowanych  roślin do wzrostu w warunkach polowych.

 

Zastosowanie metody transformacji roślin przy użyciu Agrobacterium ma wiele ograniczeń, są to m.in. dobór odpowiedniej rośliny, od gatunku rośliny zależy wydajność transformacji oraz w przypadku roślin, u których odtworzenie całej rośliny z eksplantatów jest trudne bądź dotychczas niemożliwe.

KOMENTARZE
Newsletter