Pół minuty magii w laboratorium

Oko ludzkie jest w stanie zarejestrować i zinterpretować różnicę w sposobie wybarwienia komórek, a następnie dokonać ich zliczenia, tylko do pewnego progu koncentracji komórek w komorze hemocytometru. Dodatkowym czynnikiem, który nie ułatwia zadania są agregaty komórek. Przy dużej koncentracji komórek, otrzymanie obiektywnego wyniku jest praktycznie niemożliwe. Niespełna 5 lat temu, duńska firma ChemoMetec A/S opracowała i wprowadziła na rynek urządzenie, którego działanie oparte jest na technice mikroskopii fluorescencyjnej.  Na dzień dzisiejszy  NucleoCounter® jest stosowany nie tylko w laboratoriach naukowych, lecz również w przemyśle farmaceutycznym, spożywczym (browary, mleczarnie), jak również w medycynie i rolnictwie (kliniki zapłodnień in vitro, stacje hodowli i rozrodu zwierząt).

Fenomen urządzenia NucleoCounter® opiera się na wbudowanym mikroskopie fluorescencyjnym, który wykrywa i przechwyca sygnały emitowane przez jodek propidyny - Propidium Iodide (PI) - wnikający do DNA jądra komórkowego. Wzbudzenie PI następuje przy fali o długości  ~540 nm (światło zielone) a emisja (fluorescencja) zachodzi przy długości fali ~600 nm (światło czerwone).  Intensywność tych sygnałów wzmacnia się 20-30’ krotnie w momencie wnikania PI w DNA jądra komórkowego. Całość tego procesu jest przechwycona przez mikroskop fluorescencyjny. Wygenerowany obraz jest rejestrowany przez kamerę CCD, a następnie poddany analizie. Otrzymany wynik jest automatycznie weryfikowany z zastosowaniem trzech czynników właściwych dla jądra komórkowego barwionego przez PI. Cały proces trwa zaledwie 30 sekund.

Czy wynik naprawdę jest obiektywny?

NucleoCounter® liczy wyłącznie jądra komórkowe, czyli cechę komórki. Stąd też nie ma możliwości, aby – jak w przypadku metody z użyciem trypan blue – jakiekolwiek inne cząstki obecne w zawiesinie, a nie będące komórkami,  mogły zostać zakwalifikowane do liczenia. Problem „umierania” komórek podczas procesu liczenia nie istnieje, gdyż jodek propidyny jest substancją neutralną dla komórek. Urządzenie bez problemu jest w stanie zliczyć jądra również tych komórek, które funkcjonują w agregatach i podać ich precyzyjną liczbę. Czynnik ludzki zostaje całkowicie wyeliminowany.

Liczenie totalnej liczby komórek

Przed przystąpieniem do liczenia totalnej liczby komórek, próbkę należy w odpowiedni sposób przygotować. Określoną objętość naszej zawiesiny komórkowej miesza się z taką samą objętością buforu lizującego, a następnie dodawana jest taka sama objętość buforu stabilizującego.  Tak przygotowany roztwór wprowadza się do kasetki - NucleoCassette™, poprzez zanurzenie w roztworze końcówki kasetki i wciśnięcie do końca tłoczka. W ten sposób określona objętość naszej próby (~50 l) jest gotowa poddania jej procesowi liczenia. NucleoCassette™ wkładamy do NucleoCounter® w celu przeprowadzenia analizy, w trakcie której nasz roztwór przechodzi przez system kanalików, mieszając się z jodkiem propidyny będącym w kasetce, aby następnie trafić do miejsca w kasecie (tzw. komory), w którym nastąpi proces liczenia. Fluorescencyjny obraz utrwalony przez kamerę CCD zostaje automatycznie poddany analizie i zliczeniu, a następnie wynik jest wyświetlony na panelu NucleoCounter® w formie: ilość komórek/ml. Opcjonalnie wynik pomiaru wraz z obrazem utrwalonym na kamerze CCD może być wyświetlony na monitorze komputera, o ile użytkownik posługuje się oprogramowaniem NucleoView.

Liczenie komórek martwych i żywych

Jak jasno wynika z powyższego opisu, metoda liczenia totalnej liczby komórek polega na uszkodzeniu błon komórkowych wszystkich komórek znajdujących się w zawiesinie, poprzez dodanie reagentu A 100 a następnie reagentu B. W wyniku tego zabiegu, jodek propidyny wnika przez uszkodzone błony komórkowe do wszystkich jąder komórek będących w zawiesinie, bez względu na to, czy przed dodaniem obu reagentów były one martwe czy żywe. Cofając się o krok wcześniej, łatwo się domyślić, że jeżeli oryginalną próbę bezpośrednio wprowadzi się do kasetki,  bez uprzedniego przygotowania (tzn. bez dodania reagentu A-100 i B), wówczas tylko jądra komórek martwych zabarwią się jodkiem propidyny. W efekcie NucleoCounter® policzy w zawiesinie jedynie komórki martwe

Na podstawie pomiarów totalnej liczby komórek i liczby komórek martwych, oprogramowanie NucleoView™ oblicza liczbę komórek żywych obrazując ją w wartości: liczba komórek żywych/ml, jak również w wartościach procentowych.

Mały instrument, wielkie działanie

NucleoCounter® charakteryzuje szybkość działania, małe zużycie próby podczas liczenia (do kasetki wprowadza się ok. 50-60 uL próby), a także brak problemu „dostrajania” urządzenia pod względem specyficzności komórek. Oznacza to, że urządzenie liczy jądra komórkowe, dlatego wielkość komórki lub jej morfologia nie ma wpływu na wynik liczenia. Warto podkreślić, że NucleoCounter®  to jedyne urządzenie na świecie, w którym objętość próby poddanej liczeniu jest każdorazowo i automatycznie  kalibrowana. Co więcej jest on w stanie zliczyć również te komórki, które są zbite w agregaty i „widzi” jedynie jądra komórkowe, stąd też nie ma możliwości, że do liczby komórek zostaną zakwalifikowane inne cząstki. Jeśli chodzi o urządzenie jak i system optyczny to nie można nie zauważyć, że jest wyjątkowo łatwy w obsłudze. Po 10 minutach szkolenia użytkownik jest w stanie obsługiwać urządzenie, które nie wymaga kalibracji. Po włączeniu jest natychmiast gotowy do pracy. Ponadto użytkownik nie musi troszczyć się o konieczność przeprowadzania kosztownych przeglądów okresowych. Wszystkie podzespoły mające kontakt z płynem, zostały usunięte z urządzenia, na rzecz NucleoCassette™.

Bożena Żukowska-Jarzyńska z firmy Hakmann przyznaje, że jak wskazuje codzienna praktyka w laboratoriach, jedną z głównych wad standardowej, manualnej techniki liczenia komórek, jest subiektywna natura tej metody. Wiedza na temat manualnej metody oraz sposób jej wykonywania zależy tylko i wyłącznie od osoby wprowadzającej w arkana tej techniki. W konsekwencji w jednym laboratorium spotyka się różnice w  wynikach liczenia podawanych przez poszczególnych pracowników. Jest to poważnym problem, w szczególności w tych procesach, gdzie precyzyjność otrzymanego wyniku liczebności komórek, jest czynnikiem krytycznym dla ważności analizy.   Wprowadzany obecnie na rynek polski NucleoCounter® stanowi niewątpliwe rozwiązanie opisanych powyżej problemów, oferując wysoką precyzję, prostotę obsługi, 20 sekundowy czas jednego liczenia i całkowity brak konieczności jego kalibracji.