Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Metody identyfikacji zrekombinowanych genów
Metody identyfikacji zrekombinowanych genów
Biotechnologia i inżynieria genetyczna, pozwalają na osiąganie coraz bardziej skomplikowanych celów eksperymentalnych, jak na przykład wyodrębnienie wysoce skonkretyzowanego genu. Jest to możliwe ponieważ na drodze wielu badań prowadzonych przez naukowców z całego świata zostało wykreowanych kilka metod

Uzyskanie konkretnego, pojedynczego genu należącego do danego organizmu jest możliwe gdy zostanie utworzony bank genów tego organizmu. Ponadto organizm taki powinien posłużyć jako podstawa do transformacji komórek drożdży lub bakterii. Następnym podjętym działaniem powinna być identyfikacja klonu komórek, które faktycznie posiadają poszukiwany gen. Ostatecznie należy dokonać izolacji DNA z komórek klonu, w tym pożądanego genu.

Według danych literaturowych i wyników porównywania w praktyce różnych metod, najłatwiej przeprowadzić identyfikację klonu zawierającego dany gen wtedy, gdy jego obecność, a konkretnie ekspresja wywołuje zmiany na poziomie fizjologii lub morfologii transformowanych komórek. Najbardziej sztandarowym przykładem jest klonowanie genu kodującego β-galaktozydazę. Komórki E. Coli transformowane bankiem genów, należy wysiać na pożywkę zawierającą X-gal. Związek ten odpowiada za pojawienie się niebieskiego zabarwienia w komórkach produkujących wspomniany enzym. Jeżeli po transformacji pojawią się komórki niewytwarzające β-galaktozydazy, wówczas nie zostaną one wybarwione na niebieski kolor.

Istnieje możliwość manipulacji komórkami transformowanymi bankiem genów w taki sposób, że przeżywalnością będą charakteryzować się wyłącznie te, które zawierają pożądany gen. Za przykład może tu posłużyć klonowanie genu odpowiadającego za biosyntezę jednego ze składników enzymatycznych procesu wytwarzania argininy w komórkach drożdży. Należy ich szczep arg- poddać transformacji i wysiać na podłoże niezasobne w argininę. Na pożywce bez argininy wyrosną wyłącznie komórki z aktywnym genem kodującym białko enzymatyczne szlaku syntezy argininy.

Może zdarzyć się, że w komórce nie dochodzi do ujawnienia syndromów stanowiących o ekspresji genu, dlatego opracowano metodę identyfikacji fragmentów DNA. Technika ta to hybrydyzacja kwasów nukleinowych. Wykorzystuje ona możliwość powstawania dwuniciowych tworów z cząsteczek, które są komplementarne względem siebie. Powstające podczas hybrydyzacji struktury dwuniciowe są stabilne, a powstają gdy chociaż kilkunastonukleotydowe odcinki kwasu nukleoidowego odpowiadają sobie pod względem komplementarności zasad azotowych. Tworzenie kompleksów z dwuniciowych fragmentów materiału genetycznego jest ściśle kontrolowane przez tzw. „temperaturę przejścia”, po przekroczeniu której dochodzi do dysocjacji elementów. Hybrydyzacja pozwala na wizualizację obszaru, w którym znajduje się dany gen. Dlatego fragment nukleotydowy dołączany do nici chromatynowej znajdującej się w komórce to tzw. sonda molekularna. Jest ona odpowiednio wyznakowana, często przy użyciu radioizotopów, bądź fluorochromów, związków fluoryzujących, czy łatwo oznaczalnych enzymów, np. biotyny. Niewątpliwym atutem stosowania metody hybrydyzacji jest sposobność do stosowania sond nie w pełni komplementarnych do szukanego odcinka DNA. To oznacza, że gen poddany wyznakowaniu nie musi mieć całkowicie poznanej struktury. Jednak im bardziej komplementarna sonda, tym lepsza wydajność hybrydyzacji i większa trwałośćtworzonego kompleksu. Specyficzność procesu hybrydyzacji określana jest następującymi parametrami: temperaturą, siłą jonowej buforu, a przede wszystkim składem nukleotydowym. Przykład stosowania techniki hybrydyzacji stanowią skomplikowane badania dotyczące wykrywania genów homologicznych u gatunków odległych ewolucyjnie. Istnieje kilka wariantów opisanej metody identyfikacji genów. Dobór typu analizy uzależniony jest m.in. od organizmu będącego modelem badawczym.

Źródła

"Genetyka molekularna" 2002 Węgleński P PWN

KOMENTARZE
Newsletter