Neutropenia wrodzona, będąca heterogenną grupą pierwotnych niedoborów odporności, odznacza się zmniejszoną liczbą granulocytów obojętnochłonnych (neutrofilii) we krwi. Częstość jej występowania określa się między 3 a 8.5 przypadków na milion osób [3]. Do tej pory diagnostyka pacjentów przeprowadzana w pierwszych latach ich życia opierała się głównie na badaniu morfologicznym krwi, ocenie objawów klinicznych oraz wykrywaniu mutacji w genie ELANE. Takie podejście pozostawiało ok. 20% osób z neutropenią wrodzoną o nieznanym podłożu genetycznym, co znacznie opóźniało proces diagnostyczny i utrudniało wprowadzenie prawidłowego leczenia. Sam stan neutropenii nie zagraża życiu pacjenta, ale brak prawidłowej diagnostyki i monitorowania przebiegu choroby może prowadzić do rozwoju ostrej białaczki szpikowej, natomiast brak odpowiedniego leczenia skutkuje wystąpieniem zagrażających życiu infekcji [4].

W ramach projektu FixNet zastosowanie technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS, Next Generation Sequencing) umożliwiło nie tylko identyfikację pacjentów z mutacjami w genie ELANE, lecz również odkrycie innych rzadkich mutacji, których mechanizm molekularny prowadzący do rozwoju neutropenii pozostaje obecnie nieznany. Istotnym efektem projektu jest rozpowszechnienie badań genetycznych na oddziałach hematologii dziecięcej oraz poszerzenie wiedzy lekarzy w zakresie interpretacji wyników genetycznych i monitorowania przebiegu tej choroby. Dzięki temu pacjenci dotychczas niezdiagnozowani lub błędnie zdiagnozowani mogli, niekiedy po wielu latach, otrzymać właściwą diagnozę.

Kolejnym etapem projektu jest opracowanie strategii naprawy mutacji znalezionych u pacjentów z neutropenią wrodzoną. Pierwszym podejściem było generowanie iPSCs z komórek nabłonkowych izolowanych z moczu zakwalifikowanych pacjentów, natomiast drugą ścieżką – wykorzystanie hematopoetycznych komórek progenitorowych CD34+ izolowanych ze szpiku kostnego. W następnym kroku za pomocą innowacyjnej metody CRISPR/Cas9 podjęto próbę naprawy mutacji sprawczych. Technika ta opiera się na wprowadzenia konstruktu do jądra komórek składającego się z guide RNA, który znajduje odpowiedni fragment DNA w genomie pacjentów oraz Cas9 działającego na zasadzie tzw. „molekularnych nożyczek”, przecinając sekwencję DNA zawierającą mutację, usuwając błędnie wstawione nukleotydy. Oprócz tego wprowadzane jest donorowe DNA, które stanowi matrycę do syntezy zdrowej wersji genu. W celu określenia efektywności zastosowanego podejścia odtworzono proces granulopoezy in vitro, różnicując zarówno iPSCs, jak i komórki CD34+ do neutrofili, aby poddać je testom funkcjonalnym. Umożliwia to porównanie takich parametrów, jak zdolność do znajdowania i zabijania bakterii na drodze fagocytozy między komórkami pierwotnie pobranymi od pacjentów ze zdiagnozowaną neutropenią wrodzoną przed i po zastosowaniu metody CRISPR/Cas9 oraz komórkami pełniącymi rolę kontroli uzyskanych od zdrowych osób. Wyniki uzyskane w ramach projektu FixNet są pierwszym krokiem do stworzenia efektywnej spersonalizowanej terapii komórkowej opartej na edycji genów dla pacjentów z neutropenią wrodzoną i innymi wrodzonymi zaburzeniami hematopoezy. 

Autorzy:

Dr n. med. Joanna Madzio, adiunkt w Klinice Pediatrii, Onkologii i Hematologii I Katedry Pediatrii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi

Agnieszka Tokarczyk, studentka, stażystka w Klinice Pediatrii, Onkologii i Hematologii I Katedry Pediatrii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi

Prof. dr hab. med. Wojciech Młynarski, kierownik Kliniki Pediatrii, Onkologii i Hematologii I Katedry Pediatrii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi