Doktor Tomasz Kobiela przy mikroskopie sił atomowych (AFM)

red. Tomasz Domagała: Jak działają mikroskopy sił atomowych?

dr inż. Tomasz Kobiela: Historia skaningowych technik mikroskopowych (z ang. Scanning Probe Microscopy, SPM) rozpoczęła się we wczesnych latach 80‑tych ubiegłego stulecia, gdy Binnig i Rohrer zrewolucjonizowali świat wyrobów mikroskopowych przez wynalezienie i skonstruowanie skaningowego mikroskopu tunelowego (Scanning Tunneling Microscope, STM). Waga tego odkrycia została błyskawicznie doceniona i już w roku 1986 ci dwaj badacze zostali uhonorowani Nagrodą Nobla w fizyce. W tym samym roku Binnig, Quate i Gerber ogłosili skonstruowanie jeszcze bardziej uniwersalnego mikroskopu – mikroskopu sił atomowych (Atomic Force Microscope, AFM). Mikroskop sił atomowych jest szczególnie przydatny przy charakteryzowaniu powierzchni próbek nieprzewodzących prądu elektrycznego. Mikroskopy SPM nie są klasycznymi konstrukcjami optycznymi – nie wykorzystują wiązek światła do obrazowania powierzchni, ale raczej ją “odczuwają”. Zasada działania tych mikroskopów polega na pomiarze zmian wybranej w danej metodzie wielkości fizycznej w czasie oddziaływania próbki ze skanującym ostrzem.

Jakiego rodzaju danych dostarcza to urządzenie?

W metodzie AFM badana powierzchnia jest skanowana w płaszczyźnie XY przez ostrze zamocowane na cienkiej dźwigni o znanej stałej sprężystości. Odwzorowanie powierzchni uzyskuje się w wyniku rejestracji zmian siły wzajemnego oddziaływania rdzeni atomowych atomówznajdujących się na końcu próbującego ostrza ostrza oraz atomów badanej powierzchni.

AFM oferuje rozdzielczość na poziomie większości oferowanych komercyjnie mikroskopów elektronowych, ale osiąga to przy stosowaniu warunków pracy typowych dla klasycznej mikroskopii optycznej. To znaczy, że próbki nie muszą być odgazowywane, czy liofilizowane, nie są również konieczne repliki, ani praca w wysokiej próżni. Dlatego AFM stała się powszechnie stosowaną metodą w dziedzinie nauk biologicznych. Możliwe jest obrazowanie zarówno całych komórek, błon komórkowych oraz pojedynczych biomolekuł w czasie rzeczywistym, w warunkach fizjologicznych, z rozdzielczością atomową.

AFM jest techniką stosowaną również przy badaniu właściwości pojedynczych cząsteczek biorących udział w oddziaływaniu molekularnym (np. pomiędzy pojedynczymi kompleksami typu ligand‑receptor), dostarczając informacji o lokalnie działających siłach, mierzonych z dokładnością kilkudziesięciu pikoniutonów. Badania tego typu umożliwiają uzyskanie parametrów opisujących rozpad kompleksu, takich jak stała szybkości dysocjacji oraz położenie bariery potencjału.

Jakie zastosowania znalazło to urządzenie w prowadzonych przez Pana dotychczas badaniach?

Ostrze czujnika AFM jest również bardzo wrażliwym urządzeniem stosowanym do mierzenia i charakteryzowania lokalnie działających sił. Jedno z głównych obecnych zastosowań AFM polega na wykorzystaniu tej techniki do mierzenia oddziaływań pomiędzy ostrzem a badaną powierzchnią w funkcji przyłożonej siły. W ten sposób możemy wyznaczyć parametry opisujące właściwości mechaniczne danego materiału. Obecnie prowadzimy badania wpływu czynników zewnętrznych na elastyczność komórek biologicznych. Bardzo ciekawe rezultaty otrzymaliśmy badając wpływ wybranych surowców kosmetycznych na sztywność komórek skóry – keratynocytów.

Badanie to wykonaliśmy we współpracy z Kliniką Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego, Wyższą Szkołą Kosmetyki i Pielęgnacji Zdrowia oraz Instytutem Fizyki Jądrowej PAN w Krakowie. Warto tutaj nadmienić, że dr hab. Małgorzata Lekka z IFJ PAN jest jedną z pierwszych osób na świecie, która zajęła się wykorzystaniem pomiarów elastyczności komórek jako kryterium dodatkowego w detekcji nowotworów.

Jak umieszcza się ligandy na ostrzu AFM?

Pomiar oddziaływań typu ligand–receptor za pomocą AFM wymaga zastosowania metod immobilizacji białek na powierzchni ostrza AFM. Klasyczną metodą wzbogacenia powierzchni ostrza w grupy aminowe jest metoda silanizacji. W metodzie tej używa się różnego rodzaju aminosilanów, związków, które jednym końcem wiążą się z powierzchnią ostrza poprzez grupę silanową, a drugim końcem z białkiem.

Należy jednak pamiętać, że AFM mierzy bezpośrednio siłę potrzebną na oderwanie zmodyfikowanego ostrza od badanej powierzchni i dopiero dokładna analiza oraz dodatkowe eksperymenty mogą udzielić odpowiedzi na pytanie: jaka jest siła oddziaływania charakterystyczna dla danej pary złożonej z pojedynczych białek?

Wspomniał Pan o badaniach nad detekcją nowotworów. Czy mógłby Pan powiedzieć o nich coś więcej?

Obecnie we współpracy z dr hab. Małgorzatą Lekką z IFJ PAN w Krakowie prowadzimy badania mechanizmu i kinetyki specyficznych oddziaływań pomiędzy wybranymi lektynami i glikoproteinami. Badania te mają na celu wykorzystanie lektyn jako biomarkerów chorobowo zmienionych komórek dzięki ich specyficznej wybiórczości do tworzenia połączeń z określonymi glikoproteinami znajdującymi się na powierzchni komórek nowotworowych. Dla uzyskania pełnego opisu parametrów kinetycznych prowadzimy badania z wykorzystaniem uzupełniającej techniki – mikrowagi kwarcowej z modułem dyssypacji energii (QCM-D). QCM-D jest niezwykle czułą metodą umożliwiającą badania oddziaływań międzymolekularnych na powierzchni biosensora.

Obrazy AFM keratynocytów: (A) - keratynocyty kontrolne, (B) - keratynocyty poddane działaniu środków powierzchniowo czynnych

W badaniach AFM planujemy modyfikację ostrza AFM za pomocą żywych komórek, co umożliwi ilościową analizę oddziaływań komórki z podłożem sensora zmodyfikowanego odpowiednimi lektynami. Oczekujemy, że opracowanie nowego sensora z lektynami jako detektorami chorobowo zmienionych komórek, może w przyszłości zdecydowanie usprawnić diagnostykę chorób nowotworowych.

Jakie perspektywy oferuje przyszłość?

Poza badaniami mającymi na celu opracowanie nowych narzędzi usprawniających diagnostykę nowotworową, komórka pracująca jako sonda AFM będzie wykorzystywana w badaniach nad komórkami tucznymi. Mastocyty biorą udział w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych, dlatego bardzo ważne jest zrozumienie mechanizmów odpowiadających za migracje tych komórek w tkankach. Procesy adhezyjne, warunkujące wiązanie się mastocytów do białek macierzy pozakomórkowej, mają zasadnicze znaczenie dla procesów migracji. Innym zagadnieniem będą badania właściwości komórek hodowanych na podłożach z polimerów biodegradowalnych.

Dziękuję za rozmowę.

Przeczytaj również:
Przełom w badaniach nad procesami starzenia!
Innowacyjna technika stymulująca nerwy do regeneracji - już wkrótce dostępna!

rozmawiał red. Tomasz Domagała
Portal Biotechnologia.pl