Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Ciepło, cieplej....DSC!
A gdyby tak sprawdzić jak potencjalny lek oddziałuje z błoną biologiczną? A gdyby tak ocenić stabilność białek lub kwasów nukleinowych? Co się stanie, gdy naszą próbkę poddamy stopniowemu ogrzewaniu? Metodą termoanalityczą, która pozwala na ocenę ważnych parametrów termodynamicznych badanych makromolekuł jest DSC, czyli skaningowa kalorymetria różnicowa (ang. differential scanning microcalorimetry).

Rozwijając temat technik kalorymetrycznych niewątpliwie należy na wstępie przypomnieć definicję entalpii. Otóż entalpia, a dokładniej jej zmiana (ΔH) jest miarą ciepła pochłanianego lub wydzielanego przez daną substancję, przy zachowaniu stałego ciśnienia.

Kalorymetria jest techniką wykorzystywana w chemii, biochemii, biologii komórki, biotechnologii, farmakologii czy też w nanotechnologii. Głównym jej założeniem jest analiza właściwości termodynamicznych lipidów, białek, kwasów nukleinowych jak również badanie stabilności nanocząstek. Zastosowanie metody DSC, popularnej odmiany kalorymetrii, związane jest z pomiarem ciepła towarzyszącego zmianom fazowym, w zależności od temperatury.  Kluczowym jest fakt, że przemiany fazowe mają miejsce w charakterystycznych dla danego układu temperaturach, co pozwala na monitorowanie ewentualnych "odchyleń".

Poza przedziałem temperatur związanych z przemianą, badana próbka również absorbuje ciepło (zależnie od jej ciepła właściwego), a zatem rejestrowany w trakcie pomiaru wykres wykazuje pewne nachylenie. Określamy je jako linię bazową.  Gdy następuje przemiana fazowa, ciepło właściwe próbki ulega zmianie, co prowadzi do zmian w nachyleniu linii bazowej.

Zmianę taką eliminuje się poprzez wykonanie tzw. pomiaru różnicującego. Do tego celu używa się tzw. próbki odniesienia, która -pomimo takiej samej jak w przypadku próbki badanej pojemności cieplnej - nie ulega przemianie fazowej. Ciepło pochłaniane przez badaną próbkę zostaje pomniejszone o wartość ciepła dla próbki odniesienia - tę operację matematyczną dokonuje kalorymetr, nazywany w związku z powyższym - różnicowym.

Typowy mikrokalorymetr różnicowy składa się z 3 układów:

  • właściwego układu badawczego,
  • układu sterującego,
  • układu różnicowego oraz rejestratora.

Właściwy układ, obejmujący dwie próbki: badaną i odniesienia, umieszczony jest w naczyniu, które dzięki swojej budowie zapobiega wymianie ciepła próbek z otoczeniem. Próbki znajdują się w odpowiednich kapsułkach, które dodatkowo je zabezpieczają, jak również w sposób równomierny zapewniają odpowiednią temperaturę. Sposób przygotowania próbek przedstawia film poniżej.

W przypadku, gdy nie mamy do czynienia z pomiarem izotermicznym, układ sterujący narzuca wzrost temperatury układu ze stałą szybkością. Rejestrowany wynik jest oczywiście różnicą pomiędzy ciepłem związanym z badaną próbką oraz próbką referencyjną. Jak można się domyśleć, gdy w układzie nie zachodzi przemiana fazowa różnica ta jest równa zeru. Jeśli w badanej próbce będzie zachodziła przemiana egzotermiczna, to ciepło do niej dostarczane będzie mniejsze niż dla kontroli.

Analogicznie, w przypadku przemiany endotermicznej - wartość ciepła będzie większa. Całkowita powierzchnia związana z zarejestrowanym pikiem kalorymetrycznym odpowiada zmianie entalpii układu podczas przemiany. Pojedynczy pik zarejestrowany w czasie przemiany fazowej daje informacje o podstawowych parametrach termotropowych:

  • ΔH (ciepło przemiany fazowej odpowiadające powierzchni piku)
  • TM (temperatura przemiany)
  • ΔT1/2 (szerokość w połowie piku, wyznaczająca kooperatywność przemiany fazowej).

Jak to wygląda w praktyce? Weźmy pod uwagę przemiany fazowe lipidów, które jak pamiętamy są głównym budulcem dwuwarstwy błon komórkowych. Zwiększenie temperatury może prowadzić do zmian w sposobie upakowania cząsteczek lipidów.

Przejście z uporządkowanej sztywnej fazy żelu Lβ' do struktury pofałdowanego żelu Pβ' (tzw. faza ripple) nazywamy przedprzejściem. Przedprzejście rejestrowane jest jako mniejszy pik na krzywej kalorymetrycznej i dotyczy zmian w obrębie polarnych główek lipidu. Główna przemiana fazowa to zmiana struktury z pofałdowanej w strukturę ciekłokrystaliczną Lα. Skutkuje ona możliwości,a izomeryzacji trans-gauche w obrębie łańcuchów węglowodorowych, a  tym samym nabyciem przez nie większej swobody. Zwiększa się również płynność dwuwarstwy lipidowej. Nakład energii potrzebny do procesu głównej przemiany fazowej jest znaczny.

Właściwości biofizyczne dwuwarstwy lipidowej błon komórkowych mają ogromne znaczenie. Dlaczego? Zwiększenie płynności błony pociąga za sobą zmiany w jej przepuszczalności dla wielu związków. Należy jednocześnie pamiętać o białkach, które umiejscowione są w dwuwarstwie lipidowej (np. kanały jonowe, transportery). Zmiany upakowania makromolekuł mogą skutkować zaburzoną aktywnością tych składników. Inną kwestią wydaje się być oddziaływanie z dwuwarstwą lipidową związków chemicznych (np. potencjalnych leków). Analiza parametrów ΔH, TM i ΔT1/2 umożliwia wstępną ocenę czy dany czynnik wbudowuje się w dwuwarstwę, jak również na jakiej wysokości (w obrębie główek polarnych czy też w hydrofobowym rdzeniu).

Oczywiście to nie jedyna możliwość zastosowania techniki DSC. Z powodzeniem można ją wykorzystać np. do badania rozfałdowania białek, przejść podwójna-pojedyncza helisa DNA czy też oddziaływań międzycząsteczkowych białek, cukrów i innych makromolekuł. To sprawia, że DSC jest jednym z podstawowych narzędzi w dzisiejszej praktyce laboratoryjnej.

Źródła

Gill P. Differential Scanning Calorimetry Techniques: Applications in Biology and Nanoscience. J Biomol Tech. 2010 Dec; 21(4): 167–193

http://www.ttrinstitute.eu/equipments

http://popups.ulg.ac.be/1780-4507/index.php?id=6568

http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fbioe.2014.00008/full

KOMENTARZE
Newsletter