Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Biblioteki peptydowe w badaniu oddziaływań białko-białko
Biblioteki peptydowe w badaniu oddziaływań białko-białko
Analiza oddziaływań między białkami to podstawowy obszar badań nad biochemią organizmów żywych, funkcjonowaniem przeciwciał i konstruowaniem leków. Spośród szeregu dostępnych metod takich jak western blot, immunoprecypitacja czy drożdżowy system dwuhybrydowy, z pomocą przychodzą także biblioteki peptydowe. Pozwalają na wysokoprzepustowe poszukiwanie partnerów wiązania oraz na precyzyjne określenie reszt uczestniczących w wiązaniu białek.


Biblioteki peptydowe to kombinacja dużej liczby peptydów odzwierciedlających dany obszar zainteresowań, taki jak bliżej nieokreślone regiony aktywne białek czy epitopy. Ilość dostępnych kombinacji uwarunkowana jest długością peptydów oraz rodzajami aminokwasów występujących w łańcuchu. Dla przykładu, sekwencja peptydu o długości 50 reszt zawierającego wszystkie 20 naturalnych L-aminokwasów występować będzie w 2050 możliwych kombinacji. Liczba ta rośnie, gdy badane peptydy zawierają dodatkowo tzw. nienaturalne aminokwasy czy modyfikacje po-translacyjne. Biblioteki peptydowe testuje się w obecności badanego białka. W kontekście zastosowań, wyróżnić można trzy główne zastosowania:

i) poszukiwanie partnerów wiązania;
ii) precyzyjne określenie reszt uczestniczących w tworzeniu wiązania;
iii) tzw. ewolucja in vitro, czyli poszukiwanie kombinacji ulepszających funkcję biologiczną.

Spośród różnorodnych odmian metodologicznych tworzenia i badania bibliotek peptydowych, wyróżnić można dwa typy bibliotek: i) fagowe biblioteki peptydowe (ang. phage displayed peptide library) oraz ii) syntetyczne biblioteki peptydowe.

 

Fagowe biblioteki peptydowe

Ten typ bibliotek wykorzystuje nośnik biologiczny – bakteriofaga (najczęściej M13). Konstrukcja bibliotek polega na tworzeniu mutantów faga, które prezentują peptydy na swojej powierzchni, jako efekt fuzji z białkami płaszcza. Metodologia tworzenia mutantów opiera się o system wektorowy, który został opisany jeszcze na początku lat 90. poprzedniego stulecia. Fagi prezentujące peptydy o przypadkowej sekwencji testuje się w obecności znanego białka unieruchomionego na nośniku. Klony wykazujące powinowactwo poddaje się elucji, namnażaniu, a obecny wektor sekwencjonuje się w celu określenia sekwencji wiążącego peptydu. Zaletą metody jest jasna zasada działania i możliwość nieograniczonej długości badanych peptydów. Jej wady to pracochłonność i ograniczenie do naturalnych aminokwasów.

 

Syntetyczne biblioteki peptydowe

Biblioteki syntetyzowane są na podłożu stałym (ang. solid-phase synthesis), co zapewnia dużą elastyczność w projektowaniu peptydów, także tych zawierających D-aminokwasy. W porównaniu do bibliotek fagowych, ich tworzenie jest mniej czasochłonne, jednak synteza ograniczona jest do krótkich sekwencji. Biblioteki te podzielić można na sześć podtypów:

i) biblioteki nakładających się peptydów (ang. overlapping peptide library), które pozwalają na fragmentaryczne odtworzenie całej długości badanego regionu;
ii) biblioteki ze skanem alaninowym (ang. alanine scanning library), w której kolejne reszty zastępowane są alaniną, co pozwala na ocenę znaczenia poszczególnych reszt w tworzeniu wiązania;
iii) skracane biblioteki peptydowe (ang. truncation peptide library) – peptydy stopniowo skracane na obu końcach pozwalają na wyznaczenie minimalnego miejsca wiązania;
iv) biblioteki ze skanem pozycyjnym (ang. positional scanning library) – reszty w regionie wiązania są systematycznie zastępowane innym aminokwasem, co pozwala ocenić wpływ danej reszty na siłę wiązania;
v) przypadkowa biblioteka peptydowa (ang. random peptide library) – reszty w badanej sekwencji zmieniane są przypadkowo, co pozwala na potencjalne zwiększenie aktywności i optymalizację sekwencji;
vi) biblioteki typu „scrambled” (ang. scrabled peptide library) – przypadkowe sekwencje peptydów o największej liczbie wariantów.

 

Zastosowanie bibliotek peptydowych wyznacza wyobraźnia i potrzeby badacza. Oprócz analizy oddziaływań międzybiałkowych w podstawowych badaniach biochemicznych, projektowanie nowych sekwencji peptydów stosuje się także w inżynierii receptorów komórkowych czy przeciwciał. Narzędzie to na pewno umożliwia wysokoprzepustowość analiz.

 

Źródła

Laura Guess, Peptide libraries: applications, design options and consideration. GenScript webinar 2015. www.genscript.com

Felici F. et al. Selection of Antibody Ligands from a Large Library of Oligopeptides Expressed on a Multivalent Exposition Vector. J. Mol. Biol. 1991

KOMENTARZE
news

<Listopad 2019>

pnwtśrczptsbnd
28
30
31
1
2
3
4
7
MEDmeetsTECH
2019-11-07 do 2019-11-07
9
40. Kongres i Targi LNE
2019-11-09 do 2019-11-10
10
11
15
16
17
22
23
24
27
28
Warsaw FOODHATON 2019
2019-11-28 do 2019-11-28
29
30
1
Newsletter