Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Sposoby oddziaływania małocząsteczkowych ligandów z DNA, czyli jak lek może wpływać na nasz materiał genetyczny
Sposoby oddziaływania małocząsteczkowych ligandów z DNA, czyli jak lek może wpływać na nasz
Odkąd poznano budowę i rolę kwasów nukleinowych w organizmach żywych badano wpływ różnorodnych substancji na ich strukturę i funkcje. Przez kilkadziesiąt lat badano również interakcje małych cząsteczek organicznych z DNA w nadziei na poznanie zasad projektowania cząsteczek ukierunkowanych na oddziaływanie ze specyficznymi sekwencjami DNA w celu kontroli ekspresji genów. Badania krystalograficzne wskazują, że podwójna helisa DNA w warunkach fizjologicznych jest zbliżona strukturalnie do modelowej formy B DNA (10,5 par zasad na skręt), a na jej powierzchni przebiegają dwa rowki (bruzdy): większy i mniejszy. W przypadku formy B DNA średnica większego rowka wynosi około 2,2 nm, a mniejszego 1,2 nm. Bruzdy są obszarami przez które inne cząsteczki mogą uzyskać dostęp do par zasad. Ich wymiary i geometria są więc ważnymi elementami rozpoznawczym dla ligandów łączących się z DNA. Szkielet fosforanowo-cukrowy DNA jest elastyczny, dzięki czemu możliwa jest zmiana stopnia skręcenia podwójnej helisy pod wpływem działania określonych czynników. Na tę elastyczność wpływa również ilość wiązań wodorowych między komplementarnymi zasadami – regiony bogate w pary zasad GC są bardziej „sztywne” niż regiony bogate w pary AT.

Generalnie definiuje się dwa podstawowe mechanizmy oddziaływania małocząsteczkowych ligandów z helisą DNA. Są to oddziaływania fizykochemiczne (wiązania niekowalencyjne) oraz tworzenie wiązań kowalencyjnych. Jednocześnie oddziaływania niekowalencyjne dzieli się na dwa nieco odmienne sposoby – interkalację oraz wiązanie w małym rowku DNA, które w odpowiedniej kolejności przedstawiono na rysunku poniżej.

 

 

Co ciekawe, bazując już na samej strukturze związku można przewidzieć sposób jego oddziaływania z DNA. W tej części omówione zostaną oddziaływania niekowalencyjne, czyli interkalacja i wiązanie w rowku podwójnej helisy, natomiast w następnej części artykułu skupimy się nad kowalencyjnym oddziaływaniem małocząsteczkowych ligandów z DNA.

 

Jak się wcisnąć...

 

Termin interkalacja pochodzi od łacińskiego intercalare, co oznacza „wsuwać się”. Jak sugeruje nazwa ten sposób niekowalencyjnego oddziaływania z DNA  polega na wsuwaniu się płaskich układów pomiędzy pary zasad w podwójnej helisie kwasu nukleinowego. Związki oddziałujące w ten sposób posiadają z reguły układy płaskich pierścieni aromatycznych i/lub heteroaromatycznych o grubości około 0,2-0,37 nm. Układy te lokują się w powstającym kompleksie interkalacyjnym prostopadle do osi helisy. Kompleks jest stabilizowany przez oddziaływania typu p-p płaskich układów aromatycznych z zasadami azotowymi DNA.  Interkalatory generalnie nie posiadają specyficzności w stosunku do sekwencji zasad, jedynie preferują miejsca z przewagą określonych par – większość „wsuwa się” między pary zasad GC. Po interkalacji pierwszo- i drugorzędowa struktura DNA nie ulegają zmianie. Zmienia się natomiast trzeciorzędowa struktura – kąt skręcenia helisy ulega „odgięciu”, a nić DNA zostaje usztywniona oraz wydłużona. Odległości między sąsiadującymi parami zasad zwiększają się średnio z 0,34 nm do około 0,7 – 0,8 nm, a kąt skręcenia helisy ulega zmianie o 10 do 26º w zależności od interkalującego ligandu. Przykładem typowego interkalatora jest m.in. amsakryna (AMSA).

 

 

...a może wygodniej będzie inaczej?

 

Poza klasyczną interkalacją istnieją związki wykazujące bardziej skomplikowane mechanizmy oddziaływania z DNA. Są one oparte na interkalacji jednak budowa ligandu wymusza nietypową strukturę kompleksu. I tak wyróżnia się tutaj:

 

- interkalatory przebijające (ang. threading intercalators) – związki posiadające aromatyczny układ interkalujący połączony z dużymi podstawnikami po jego przeciwnych stronach. Oddziaływanie z DNA polega na typowym dla interkalacji wsunięciu się płaskiego układu pomiędzy pary zasad, przy czym podstawniki lokują się zarówno w małym jak i dużym rowku helisy. Wynika stąd, że jeden z podstawników musi „przecisnąć się na drugą stronę” między parami zasad.  Wymusza to więc, co najmniej chwilowo, większe odkształcenie podwójnej helisy DNA oraz zapewnia większą stabilność kompleksu ligand-DNA w porównaniu z sytuacją, gdy zachodzi typowa interkalacja. Ciekawym i dobrze przebadanym przykładem związków interkalujących i wiążących się z DNA jednocześnie w obydwu rowkach jest nogalamycyna. Jest to antybiotyk antracyklinowy zbudowany z interkalującego pierścienia antrachinonu oraz dwóch podjednostek cukrowych ulokowanych po jego przeciwnych stronach. Podjednostki te po interkalacji chromoforu lokują się „wystając” do obu rowków DNA, jednak aby doszło do całkowitej interkalacji pierścienia jedna z reszt cukrowych musi „przecisnąć się” przez pary zasad DNA. Powoduje to częściowe odkształcenie struktury DNA.

 

 

 - bisinterkalatory (interkalatory bifunkcyjne) – związki zbudowane z dwóch interkalujących układów pierścieni aromatycznych połączonych konformacyjnie labilnym łącznikiem (linkerem). Układy skondensowanych pierścieni w bisinterkalatorach mogą być identyczne lub różne. Dowiedziono również, że budowa i długość łącznika może wpływać na selektywność sekwencyjną i zdolność wiązania się z DNA. Interkalatory tego typu wykazują większe stałe wiązania niż odpowiednie monomery. Te właśnie wysokie stałe wiązania oraz duża specyficzność wiązania do DNA są przyczyną prowadzenia intensywnych badań nad tą klasą związków. Przykładem bisinterkalatora jest związek WP631, będący dimerycznym analogiem daunorubicyny, którego dwa układy antracyklinowe połączone są fragmentem p‑ksylenowym umiejscawiającym się w małym rowku DNA. WP631 wykazuje wysoką aktywność biologiczną i jest w stanie pokonać specyficzną formę oporności wielolekowej w hodowanych komórkach. Z tego względu był jednym z filarów chemioterapii przez wiele lat.

 

 

- bisinterkalatory przebijające – związki zwykle makrocykliczne, zbudowane z dwóch układów pierścieni aromatycznych połączonych kowalencyjnie łącznikami znajdującymi się po przeciwnych stronach pierścieni. Mechanizm oddziaływania polega na interkalacji układów aromatycznych oraz umiejscowieniu się łącznika w małym lub dużym rowku podwójnej helisy DNA. Przykładem może być związek SDM wykazujący aktywność przeciwnowotworową.

 

- multi-interkalatory – związki, w których strukturze znajduje się kilka płaskich układów aromatycznych. Stwierdzono, że ze względu na zawadę przestrzenną równocześnie do DNA interkalować mogą co najwyżej trzy z nich.

 

Może jednak się nie wciskać...

 

Innym sposobem niekowalencyjnego oddziaływania z DNA jest wiązanie się do małej bruzdy nici kwasu nukleinowego. Mechanizm ten wymusza specyficzną budowę chemiczną cząsteczek. Konieczność dopasowania się związku do kształtu małego rowka wymaga dużej labilności konformacyjnej struktury ligandu. Cechą charakterystyczną tych związków jest występowanie kilku pojedynczych (rzadziej podwójnych) pierścieni połączonych krótkim linkerem. Warunkiem trwałości kompleksu jest wystąpienie oddziaływań fizykochemicznych (zwykle wiązań wodorowych) pomiędzy grupami funkcyjnymi ligandu, a grupami funkcyjnymi we wnętrzu małego rowka Związki oddziałujące z DNA w małym rowku wykazują zwykle większe powinowactwo do regionów bogatych w pary zasad AT. Wynika to z faktu, że odpowiednie skręcenie pierścieni aromatycznych ligandu umożliwia wystąpienie korzystnych oddziaływań van der Waalsa w ścianach rowków i wiązań wodorowych z parami zasad AT. Dodatkowo grupy aminowa guaniny i karbonylowa cytozyny w miejscach bogatych w pary zasad GC tworzą zawadę przestrzenną hamując sterycznie wiązanie ligandu. Do tej klasy związków należy m.in. barwnik fluorescencyjny Hoechst 33258 będący AT – selektywnym ligandem dla którego wykazano szczególnie duże powinowactwo do sekwencji A3T3. Dzięki zdolności przenikania przez nieuszkodzone błony biologiczne jest on wykorzystywany do wybarwiania zarówno żywych jak i martwych komórek.

 

...albo połączyć sposoby?

 

Związki zbudowane zarówno z wielopierścieniowych układów jak i elastycznych łańcuchów bocznych mogą oddziaływać z helisą DNA przez interkalację jak i wiązanie się z rowkami DNA. Takim związkiem jest m.ni. aktynomycyna D – antybiotyk o aktywności przeciwnowotworowej zbudowany z pierścienia fenoksazonowego i dwóch połączonych z nim pentapeptydów, których końcowe grupy karboksylowe tworzą makrocykliczne pierścienie laktonowe. Aktynomycyna D tworzy z podwójną helisą DNA kompleks o stechiometrii 1:1. Chromofor (pierścień fenoksazonowy) interkaluje pomiędzy dwie pary zasad GC a cykliczne polipeptydy wystają jeden ponad, a drugi pod pierścieniem lokując się w małym rowku.

 

Omówione powyżej sposoby są najczęściej spotykanymi typami oddziaływań niekowalencyjnych małocząsteczkowych ligandów z DNA analizowanymi podczas badań zarówno nad nowymi jak i obecnymi już na rynku lekami. Stwierdzono również jednak istnienie związków, które zależnie od sekwencji zasad podwójnej helisy DNA mogą oddziaływać z nim poprzez interkalację lub wiązanie się w małym rowku. Taki zależny od sekwencji sposób wiązania wykazuje barwnik DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol). Ta heterocykliczna amina jest związkiem AT ‑ selektywnym przy wiązaniu do małego rowka, jednak w przypadku fragmentów bogatych w pary GC interkaluje pomiędzy pary zasad.

 

 

KOMENTARZE
Newsletter