Zawartość poradnika:

• Czym charakteryzuje się Real-Time PCR i w jakich sytuacjach się go stosuje?
• PCR vs. real-time PCR
• Etap przedanalityczny – krytyczny dla dobrze przeprowadzonego doświadczenia
• Przygotowanie matrycy
• Projektowanie eksperymentu – projektowanie starterów i sondy
• Skład mieszaniny reakcyjnej
• Strategie monitorowania przyrostu produktu – rodzaje sond
• Wybór aparatury
• Analiza najczęściej popełnianych błędów podczas wykonywania reakcji Real-time PCR
• Podsumowanie

Czym charakteryzuje się Real-Time PCR i w jakich sytuacjach się go stosuje?

W odróżnieniu od klasycznej reakcji łańcuchowej polimerazy, która umożliwia nam analizę wyłącznie etapu końcowego reakcji, po zakończonej amplifikacji (faza plateau), PCR w czasie rzeczywistym umożliwia nam również pogląd fazy wzrostu wykładniczego, logarytmicznego, a także poprzedzającą je fazę wstępną. W pierwszych etapach reakcji, czyli w fazie wstępnej następuje powolne powielenie produktu. Długość tej fazy związana jest z wyjściowym stężeniem DNA stanowiącego matrycę. W miarę przyrostu produktu, poziom fluorescencji przekracza poziom tła. Cykl reakcji, w którym nastąpiło przekroczenie tego poziomu oraz wejście w fazę wzrostu wykładniczego zwany jest cyklem progowym (C_T, ang. threshold cycle lub C_P, ang. crossing point), produkt osiąga wartość progową fluorescencji (F_T, ang. fluorescence treshold). Im wyższe wyjściowe stężenie matrycowego DNA, tym krzywa amplifikacji szybciej przekroczy wartość progową. Wyznaczenie punktu przecięcia linii progowej dla określonego produktu, oraz wykreślenie krzywej standardowej dla punktów przecięcia zastosowanego szeregu standardów umożliwia wykonanie pomiaru ilościowego oraz podanie konkretnych wartości liczbowych dla ilości kopii określonego amplikonu w badanym materiale.

Ze względu na dużo wyższą czułość niż klasyczna PCR, Real-time, PCR umożliwia detekcję nawet przy nie wielkim wyjściowym stężeniu matrycy. Z tego względu znalazła szerokie zastosowanie m.in. w diagnostyce mikrobiologicznej. Umożliwia oznaczenia ilościowe oraz jakościowe obecności materiału genetycznego określonego patogenu w materiale klinicznym. Z powodzeniem znajduje zastosowanie w przypadku diagnostyki patogenów trudnych do identyfikacji klasycznymi metodami. W diagnostyce stosowana jest również w identyfikacji mutacji genetycznych związanych z określonymi procesami chorobotwórczymi czy predyspozycją do określonych jednostek chorobowych. Szeroko stosowana jest przy ocenie ekspresji genów oraz metabolizmu leków. W przemyśle spożywczym znalazła zastosowanie przy analizie obecności GMO oraz jego ilości w produktach spożywczych.

PCR vs. Real-time PCR

Najistotniejszymi zaletami zastosowania techniki Real-time PCR to jej dużo wyższa czułość i precyzja. Technika ta umożliwia nam analizę materiału nawet o niewielkim stężeniu wyjściowym DNA. Czynnikiem przemawiającym na korzyść Real-time PCR jest również możliwość przeprowadzania analiz ilościowych z podaniem konkretnych wartości liczbowych określających ilość kopii określonego amplikonu w jednostkach objętości.  Ze względu na fakt, iż nie wymaga przeprowadzenia dodatkowych etapów mających na celu wizualizację uzyskanych produktów, metoda jest znacznie mniej czaso- i pracochłonna. Pomijając etap przeniesienia próbek na żel w celu przeprowadzenia elektroforezy zmniejszone zostało również ryzyko kontaminacji próbek innymi produktami po reakcji PCR. Real-time PCR charakteryzuje również szeroki zakres oznaczanych stężeń oraz wysoka powtarzalność uzyskiwanych wyników. W zasadzie jedynymi wadami wydają się być wymagania sprzętowe oraz wyższy koszt analizy.

Etap przedanalityczny – krytyczny dla dobrze przeprowadzonego doświadczenia

Istotnym etapem jest etap przedanalityczny, związany m.in. z pobraniem materiału, jego przechowywaniem i izolacją. Istotne jest zachowanie warunków czasowych i temperaturowych. Niewłaściwe obchodzenie się z materiałem może wpłynąć na jego degradację lub uzyskanie materiału złej jakości, co w konsekwencji może doprowadzić do uzyskania wyników fałszywie negatywnych lub w przypadku oznaczeń ilościowych uzyskania wartości zaniżonych. Należy zaznaczyć, że najwrażliwsze na proces przedanalityczny jest RNA. W przypadku analizy RNA, punkt krytyczny stanowi również etap odwrotnej transkrypcji, czyli przepisania informacji w nim zawartej na cDNA. Również od wydajności tego etapu zależy prawidłowość dalszych oznaczeń.

Przygotowanie matrycy

Matrycę do reakcji Real-time PCR stanowi DNA lub RNA. W przypadku analizy RNA po zakończonej izolacji wymagane jest przeprowadzenie odwrotnej transkrypcji w celu przepisania informacji genetycznej na cDNA. Technika uniemożliwia nam analizę bezpośrednio RNA, białek, lipidów czy innych składników komórkowych. Izolacja kwasów nukleinowych najczęściej zachodzi z wykorzystaniem komercyjnych zestawów wykorzystujących zdolność specyficznego wiązania DNA lub RNA do złóż krzemionkowych, jego obmycie z zanieczyszczeń i elucję w końcowym etapie izolacji. Podstawowym założeniem tego etapu jest uzyskanie izolatów z maksymalną wydajnością, wysokocząsteczkowych, przy jednoczesnym oczyszczeniu preparatów z białek i inhibitorów reakcji. W przypadku niektórych analiz, m.in. wykorzystujących topienie wysokiej rozdzielczości (ang. HRM, High Resolution Melt) istotna jest normalizacja stężeń DNA przed dodaniem go do reakcji. Niezrównoważone stężenia próbek analizowanych w jednej reakcji mogą wpływać na błędną interpretację wyników. W przypadku analizy RNA po zakończonej izolacji istotne jest przeprowadzenie – wcześniej wspominanej – odwrotnej transkrypcji.

Projektowanie eksperymentu - projektowanie starterów i sondy

W przypadku reakcji Real-time PCR istotny jest dobór optymalnych warunków reakcji PCR, gwarantujących maksymalną wydajność oraz specyfikę zachodzącej amplifikacji. Pierwszym etapem jest zaprojektowanie odpowiednich starterów i sondy.

W praktyce trudniej zaprojektować sondę, dlatego lepiej wcześniej wybrać potencjalne miejsce przyłączenia sondy, zanim zaprojektuje się startery. Sondę należy dobrać tak, aby jej temperatura topnienia była o ok. 10°C wyższa od temperatury topnienia starterów. W przeciwnym razie, po zakończonej denaturacji, starter wydłużany przez polimerazę może zablokować miejsce łączenia się sondy. Istotny jest również dobór odpowiednich barwników reporterowych i wygaszaczy fluorescencji. Przy wyborze barwnika należy kierować się dostępnymi kanałami detekcji w aparacie. Najczęściej stosowane sondy to FAM (dająca odczyt na kanale zielonym) oraz YOE czy VIC (odczyt na kanale żółtym). Przy prowadzeniu reakcji typu "multiplex" barwniki należy dobrać w taki sposób, aby zminimalizować ryzyko nachodzenia na siebie ich widm. W przeciwnym razie może dojść do "przebicia" sygnału na drugi kanał detekcji. Analiza ekspresji genów wymaga od nas wyboru odpowiedniego wewnętrznego genu referencyjnego (ang. housekeeping gene). W praktyce nie istnieje idealny gen referencyjny, dlatego należy wybrać taki, który charakteryzuje się względnie stałą ekspresją w różnych warunkach eksperymentalnych. Technika HRM wymaga od nas szczególnej uwagi przy projektowaniu warunków reakcji, ustalenia optymalnych warunków amplifikacji, użycia odpowiednich barwników przeznaczonych do tego typu analiz (SYBR Green się nie nadaje). Od aparatu wymagany jest precyzyjny pomiar poziomu fluorescencji towarzyszącym zmianom temperatury nawet o 0.1^oC. Zaleca się przeprowadzenie analizy w większej ilości powtórzeń dla pojedynczej próbki oraz każdorazowo normalizacja stężeń dla próbek oznaczanych w jednej partii.

Projektowane startery powinny być wysoce specyficzne do amplifikowanej sekwencji. W przypadku Real-time PCR stosuje się takie same zasady projektowania starterów, jak w klasycznej PCR. Optymalna długość startera to od 18 do 22 nukleotydów. Temperatury topnienia starterów z jednej pary nie powinny różnić się o więcej niż 5°C. Standardowa temperatura topnienia powinna zawierać się w przedziale 52-58°C. Im wyższa temperatura topnienia tym niższe ryzyko uzyskania niespecyficznych produktów reakcji. Dla stabilności wiązania startera z matrycą istotne jest zachowanie zawartości par guaniny (G) i cytozyny (C) w przedziale 40-60%. Istotny jest również zrównoważony rozkład nukleotydów GC i AT. Należy unikać starterów z długimi powtórzeniami jednego z nukleotydów (>3,4). Dla uzyskania wysokiej wydajności reakcji należy unikać starterów tworzących struktury drugorzędowe lub struktury typu primer-dimer między oligonukleotydami z jednej pary starterów. Jest to szczególnie istotne w przypadku stosowania w reakcji barwników interkalujących, które łączą się we wszystkie dwuniciowe struktury w mieszaninie reakcyjnej. W takiej sytuacji możliwe jest uzyskanie sygnału nie tylko z interesującego nas produktu, ale również z niespecyficznych produktów reakcji oraz struktur drugorzędowych utworzonych między starterami.

Temperatura topnienia oraz powyższe parametry muszą być podobne dla obydwu starterów. Po zaprojektowaniu pary starterów należy sprawdzić specyfikę sekwencji z sekwencją docelową. W następnym etapie pozostaje już eksperymentalnie ustalić warunki reakcji z maksymalną wydajnością oraz specyfiką. W kolejnych etapach pozostaje już sprawdzić warunki z dodatkiem znacznika fluorescencyjnego oraz próby z materiałem klinicznym.

W Centrum Edukacji Bio-Medycznej prowadzone są szkolenia, poświęcone tematyce projektowania starterów i sond oraz optymalizacji warunków do reakcji Real-time PCR. Część wykładowa pozwala zapoznać się z warunkami projektowania oraz optymalizacji, a warsztaty dają możliwość sprawdzenia nabytej wiedzy w praktyce.

Skład mieszaniny reakcyjnej

Skład mieszaniny reakcyjnej do Real-time PCR jest bardzo zbliżony do tego wykorzystywanego w klasycznej PCR. Istotnymi elementami są DNA lub cDNA stanowiące matrycę dla nowo syntetyzowanej nici. Kolejnymi istotnymi składnikami są: mieszanina czterech trifosforanów deoksyrybonukleotydów stanowiących budulec dla nici potomnej, para starterów komplementarnych do sekwencji docelowej, barwnik interkalujący lub sonda wyznakowana fluorescencyjnie. Składnikiem, na który powinniśmy szczególnie zwrócić uwagę jest odpowiednia polimeraza DNA. Wybór polimerazy determinowany jest przez zastosowaną strategię monitorowania przebiegu reakcji (patrz poniżej). Zastosowanie sond typu TaqMan wymaga zastosowania polimerazy z aktywnością 5’-3’ egzonukleazową, w przypadku barwników interkalujących zaleca się stosowanie polimeraz typu Hot-start. Dla zapewnienia optymalnych warunków dla działania polimerazy wymagane jest zastosowania buforu gwarantującego optymalne pH oraz odpowiednie stężenie jonów magnezu. W praktyce istnieje możliwość zakupu komercyjnych zestawów do reakcji Real-time PCR o optymalnym składzie mieszaniny reakcyjnej. Zastosowanie tego typu zestawów wymaga od nas jedynie dodania starterów oraz matrycy.

Niektóre składniki odczynników wykorzystywanych do sporządzania mieszaniny reakcyjnej, mogą osadzać się na dnie pojemnika przechowywanego w zamrażarce lub lodówce. Należy zatem pamiętać o dokładnym wymieszaniu odczynników przed rozpoczęciem pipetowania.

Strategie monitorowania przyrostu produktu – rodzaje sond

Wyróżnia się dwie podstawowe strategie umożliwiające monitorowanie przyrostu produktu w czasie rzeczywistym. Strategie przedstawione zostały poniżej.

• Barwniki interkaclujące – barwniki fluorescencyjne interkalujące w strukturę dwuniciowego DNA. Początkowo wykazują emisję słabej fluorescencji, której poziom wzrasta po związaniu się barwnika z dwunicową strukturą DNA. Technika nie wymaga zastosowania skomplikowanej sondy, co znacznie obniża koszty. Wadą stosowania barwników interkalujących jest fakt, iż łączą się do każdej dwunicowej struktury DNA. Oprócz sekwencji docelowej możliwe jest uzyskanie wyniku dla niespecyficznych produktów reakcji, struktur drugorzędowych tworzących się w obrębie startera lub strukturami primer-dimer. W związku z powyższym szczególnie istotne jest zagwarantowanie specyfiki reakcji lub uzupełnienie analizy o wygenerowanie krzywych topnienia, które umożliwiają odróżnić produkt docelowy od afektorów. Najczęściej stosowane barwniki to SYBR Green oraz stosowane w technice HRM EvaGreen, LCGreen i inne.
• Sondy fluorescencyjne – to znakowane fluorescencyjnie oligonukleotydy. Ze względu na komplementarność do sekwencji docelowej dodatkowo zwiększają specyfikę reakcji. Działanie sond oparte jest na zjawisku bezpromienistego transferu energii (ang. FRET, ang. fluorescence resonance energy transfer). Poniżej wymienione zostały najczęściej stosowane sondy:
  • Sondy TaqMan – Tzw. „sondy degradacyjne”, oligonukleotydy znakowane na jednym końcu 5’ barwnikiem fluorescencyjnym reporterowym a na końcu 3’ barwnikiem wygaszającym fluorescencję (ang. quencher). Barwnik reporterowy nie może emitować fluorescencji w bezpośredniej bliskości wygaszacza. Emisja następuje po hydrolizie sondy przez aktywność 5’->3’ egzonuklazową Taq polimerazy (bądź innej polimerazy posiadającej taką aktywność). Następuje wówczas oddzielenie reportera od wygaszacza i wzrost poziomu fluorescencji.
  • Sondy hybrydyzacyjne – HybProbe; strategia opiera się na wykorzystaniu dwóch sond komplementarnych do sekwencji docelowej, jedna sonda znakowana na końcu 3’ donorem energii, druga natomiast na końcu 5’ akceptorem. Do emisji dochodzi w przypadkuprzyłączenia się do matrycy obydwóch sond w odległości nie większej niż 5 nt. Następuje wówczas transfer energii z donora na akceptor i wzrost fluorescencji. Na etapie wydłużania DNA, obie sondy fluorescencyjne są usuwane z kompleksu i fluorescencja zanika. Stąd natężenie fluorescencji na etapie hybrydyzacji jest proporcjonalne do ilości kopii badanej sekwencji DNA na końcu poprzedniego cyklu PCR.
  • Molecular Beacon – sondy DNA tworzące dzięki komplementarności fragmentów oskrzydlających strukturę spinki do włosów. Znakowane na końcach barwnikiem reporterowym i wygaszaczem. Środkowa część sondy musi być idealnie komplementarna do matrycy – niedopasowanie kompleksu sonda-matryca faworyzuje strukturę "spinki do włosów" sondy. Sonda ulega rozpleceniu w przypadku napotkania sekwencji w pełni komplementarnej do sekwencji wewnętrznej sondy. Następuje wówczas oddzielenie reportera i wygaszacza oraz emisja fluorescencji. Sondy tego typu uznawane są za najczulsze narzędzie służące do wykrywania mutacji typu SNP.
  • Sondy Skorpion – najbardziej skomplikowane w swej budowie. Stanowią modyfikację sondy typu Molecular Beacon. Modyfikacja polega na dołączeniu do  struktury spinki startera dla reakcji PCR. Pomiędzy końcem 5’ startera i 3’ sondy znajduje się element blokujący polimerazę DNA oraz wygaszacz fluorescencji, koniec 3’ sondy wyznakowany jest fluorochromem. Wolny koniec 3’ startera umożliwia przyłączenie polimerazy i wydłużenie komplementarnej nici. Po denaturacji struktura „spinki” zostaje rozerwana, a sonda zgina się
    o 180 ⁰ i wiąże do nowo zsyntetyzowanej nici.

Wybór aparatury

Reakcja przeprowadzana jest w termocyklerze umożliwiającym detekcję fluorescencji w trakcie trwania reakcji. Sprzęt stosowany w Real-time PCR powinien umożliwić utrzymanie narzuconych parametrów podczas całej reakcji, znaczną szybkość zmian temperatury, precyzję pomiaru, dokładność oraz powtarzalność wyników reakcji. Na rynku dostępnych jest wiele aparatów umożliwiających monitorowanie w czasie rzeczywistym. Mogą istotnie różnić się budową, źródłem wzbudzania fluorescencji, sposobem detekcji. Przy wyborze powinniśmy kierować się ilością kanałów detekcji (szczególnie istotne przy wykonywaniu analiz typu „multiplex”), opcją dodatkową HRM, dostępnym oprogramowaniem umożliwiającym ustalenie warunków reakcji oraz analizę wyników, a także w przypadku wykonywania analiz dla celów diagnostycznych posiadanymi certyfikatami (CE, IVD).

Analiza najczęściej popełnianych błędów podczas wykonywania reakcji Real-time PCR

Częstym błędem jest nieodpowiedni wybór barwnika fluorescencyjnego. Przy jego wyborze musimy kierować się dostępnymi kanałami detekcji w aparacie. Istotnym błędem jest brak stosowania każdorazowo kontroli reakcji. W każdej partii powinno zastosować się kontrolę pozytywną (lub szereg rozcieńczeń określonego standardu w przypadku analizy ilościowej), która informuje nas o prawidłowości zachodzącej reakcji. Kolejną kontrolą jest kontrola negatywna reakcji. W praktyce stosuje się dwie kontrole tego typu. Pierwsza z nich zamiast DNA lub cDNA zawiera wodę. Kontrola tego typu ma na celu sprawdzić czystość odczynników i wykluczyć ewentualną ich kontaminację obcym materiałem genetycznym. Druga kontrola negatywna zawiera DNA negatywne pod względem badanej cechy np.: materiał od pacjenta, u którego nie stwierdzono sekwencji docelowej analizowanego patogenu. Ostatnią kontrolą jest kontrola wewnętrzna reakcji. Jej rolą jest wykluczenie inhibicji. Szczególnie istotna w przypadku próbek, dla których uzyskaliśmy brak produktu amplifikacji.

Często popełnianym błędem jest nadmierne zwiększanie ilości cykli. Zwiększanie ich ilości powyżej 45 istotnie podwyższa ryzyko uzyskania niespecyficznych produktów amplifikacji.

Podsumowanie

Obecnie, nie ma chyba na świecie laboratorium, które nie wykonywałoby reakcji Real-time PCR. Metoda coraz częściej stosowana jest do ilościowego określania ekspresji specyficznych genów, również w diagnostyce medycznej i mikrobiologicznej.

Szczegółową wiedzę o użyteczności metody w powyższych dziedzinach można zdobyć na specjalistycznych, tematycznych kursach, poświęconych technice Real-time PCR, organizowanych przez Centrum Edukacji Bio-Medycznej w Poznaniu. Uczestnik pozna m.in. różne metody izolacji genomowego DNA, RNA, oraz wykorzystanie reakcji Real-time PCR w identyfikacji infekcji wirusowych oraz zakażeń bakteryjnych i grzybiczych. Część warsztatowa pozwoli na wspólną analizę najczęściej popełnianych błędów przy wykonywaniu reakcji, co pozwoli uniknąć podobnych problemów we własnej praktyce laboratoryjnej. Więcej informacji na stronie organizatora poświęconej szkoleniu: "Zastosowanie metody Real-Time PCR w diagnostyce medycznej i mikrobiologicznej"

Opracowali:

mgr inż. Biotechnologii Joanna Odważna, Diagnosta laboratoryjny, ekspert Centrum Edukacji Bio-Medycznej

red. Ewa Drzazga
red. Tomasz Domagała