Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Jak powstaje wzorzec masy DNA?
Jak powstaje wzorzec masy DNA?
Markery DNA są powszechnie stosowane w laboratoriach do określania wielkości badanego fragmentu DNA z zastosowaniem elektroforezy. Wzorce masy DNA są przygotowywane na różne sposoby, a do ich otrzymywania wykorzystuje się m.in. enzymy restrykcyjne, czy mieszanie produktów PCR o określonej wielkości. Rozwój technologii sprawia, że produkcja wzorców masy DNA na większą skale staje się coraz tańsza i mniej czasochłonna.

Marker DNA jest roztworem cząsteczek DNA o różnej długości, stosowanym jako odniesienie w celu oszacowania wielkości badanego fragmentu DNA rozdzielonego na żelu agarozowym bądź poliakrylamidowym podczas procesu elektroforezy. Wzorce masy DNA są powszechnie stosowane w laboratoriach. Istnieją różne sposoby ich przygotowywania.

Jedną z metod jest użycie enzymów restrykcyjnych do oddzielenia DNA genomowego od bakteriofaga lambda, małpiego wirusa lub plazmidowego DNA bakterii i pocięcia na fragmenty o odpowiednich rozmiarach. Produkcja znacznika nie jest w pełni kontrolowana, ze względu na to, że wielkość poszczególnych fragmentów określana jest przez pozycje miejsc restrykcyjnych wybranych enzymów.

Innym sposobem wytwarzania wzorców masy DNA jest wykorzystanie metody łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) do powielenia fragmentów DNA o określonych rozmiarach. Jest to prosta, efektywna i szybka metoda, obecnie powszechnie stosowana w wielu laboratoriach. Przy tworzeniu wzorców masy istotnym jest zaprojektowanie starterów odpowiadającym wielkości przewidywanych produktów PCR i dostosowanie warunków samej reakcji.

Wybór starterów uzależniony jest od zastosowanej matrycy DNA, powszechnie wykorzystywany jest bakteriofag lambda. Startery projektuje się w oparciu o sekwencję DNA i zamawia u odpowiedniej firmy biotechnologicznej. Przykładowe protokoły przeprowadzenia reakcji PCR dla wzorców masowych są ogólnodostępne, bazując o nie można dostosować warunki w zależności od oczekiwanych rezultatów. Wielkość otrzymanych produktów PCR należy skontrolować stosując elektroforezę na żelu agarozowym, istotna jest również precypitacja etanolem otrzymanych prób w celu ich oczyszczenia. Tak otrzymane fragmenty DNA miesza się ze sobą uzyskując tzw. drabinkę DNA. Znaczniki masy DNA można również otrzymać stosując technikę multipleks PCR z wykorzystaniem kilku zestawów starterów jednocześnie, jednak utrudnione jest tu dostosowanie intensywności poszczególnych fragmentów.

Produkcja wzorców masy DNA jest opłacalna na większą skalę. Firmy biotechnologiczne mają dokładnie opracowane protokoły i dostęp do nowoczesnych technologii, co sprawia że proces produkcji jest stosunkowo tani i mało czasochłonny.

 

Źródła
  • Simplified preparation of a DNA ladder Rusing PCR. T. Y. Wang; Genetics and Molecular Research 10 (3): 1631-1635 (2011);
  • Straightforward Procedure for Laboratory Production of DNA Ladder. VoThi Thuong Lan; Hindawi Publishing Corporation, Journal of Nucleic Acids, 2012
KOMENTARZE
Newsletter