Zakład Biologii i Obrazowania Komórki

Wydział Biologii i Nauk o Ziemi

Tematyka badań naukowych:

• Opracowywanie nowych, dokładnych i precyzyjnych metod korekcyjnych dla ilościowej analizy pierwiastków w materiałach biologicznych metodą mikrowiązki elektronowej. Rozwiązania teoretyczne w oparciu o symulacje Monte Carlo i ich eksperymentalna weryfikacja.

• Badania nad mechanizmami okołodobowej plastyczności neuronalnej/synaptycznej (ang. circadian plasticity) w układnie nerwowym. Okołodobowa rytmika zmian morfologicznych i ekspresji genów neuronów i komórek glejowych w układzie wzrokowym Drosophila melanogaster.

• Badania osteokonduktywnych i osteoinduktywnych własności materiałów implantacyjnych w hodowlach komórek macierzystych i osteoprogenitorowych ludzi i gryzoni – hodowle 2D i 3D na eksperymentalnych podłożach i rusztowaniach oraz w hodowlach dynamicznych (tj hodowle poddane dynamicznemu przepływowi płynów hodowlanych).

Potencjalne zastosowanie prowadzonych badań naukowych:

• Precyzyjna i dokładna ocena ilościowa pierwiastków w tkankach i komórkach oraz innych materiałach pochodzenia biologicznego, a także polimerach i macierzach zbudowanych z pierwiastków lekkich. Analiza rozmieszczenia pierwiastków w powyższych materiałach.

• Obrazowanie komórkowych zmian morfologicznych oraz ekspresji genów i białek

• Poznanie mechanizmów biologicznych inicjowanych w wyniku kontaktu komórek kościotwórczych z materiałem bioobojętnym lub bioaktywnym; typowanie materiałów o własnościach promujących regenerację tkanki kostnej.

Potencjalne usługi badawcze:

• Przygotowanie materiałów biologicznych i polimerowych uwodnionych do obserwacji w mikroskopie elektronowym skaningowym metodami chemicznymi i niskotemperaturowymi.

• Przygotowanie materiałów biologicznych i polimerowych uwodnionych metodami niskotemperaturowymi do obserwacji i analiz składu pierwiastkowego.

Szkolenia z zakresu:

- przygotowania materiałów pochodzenia biologicznego do obserwacji w mikroskopie elektronowym skaningowym;

- przygotowania materiałów pochodzenia biologicznego do analiz składu pierwiastkowego;

- przygotowania wzorców do ilościowej analizy składu pierwiastkowego materiałów biologicznych i innych o niskiej liczbie atomowej;

- ilościowej analizy składu pierwiastkowego w materiałach biologicznych w oparciu o dostępne komercyjnie metody obliczeniowe w technikach mikrowiązkowych;

- obsługi mikroskopu elektronowego skaningowego oraz mikroanalizatora pierwiastków opartego na spektrometrii dyspersji energii;

- przygotowania materiału komórkowego oraz analizy populacji komórek przy użyciu cytometrii przepływowej – apoptoza, obecność antygenów powierzchniowych, zawartość DNA, liczebność populacji, wielkość komórek;

- obsługi cytometru przepływowego;

- przygotowanie materiału komórkowego i tkankowego do obserwacji we fluorescencji (mikroskopia fluorescencyjna szerokiego pola i mikroskopia konfokalna) – immunoznakowanie;

- obrazowanie tkanek i komórek mikroskopią fluorescencyjną szerokiego pola i mikroskopią konfokalną z zastosowaniem technik dekonwolucyjnych, metody FRET i FRAP.

• Obrazowanie komórek w mikroskopie świetlnym, konfokalnym i elektronowym;
• Morfometryczna analiza obrazu;
• Analiza ekspresji genów i białek;
• Analiza procesów biologicznych i wpływu wybranych substancji chemicznych na te procesy, na modelu muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Szkolenia z zakresu:

- metod przygotowania tkanek do obrazowania w mikroskopie świetlnym, konfokalnym i elektronowym (TEM, SEM);

- metod obrazowania komórek (metody mikroskopowania);

- morfometrycznej analizy obrazu;

- metod badań nad rytmami biologicznymi;

- zasad hodowli (i technik krzyżowania) szczepów transgenicznych Drosophila melanogaster.

• Analizy potencjału kościotwórczego komórek macierzystych i osteoprogenitorowych w hodowlach 2D i 3D na komercyjnie dostępnych i eksperymentalnych podłożach i rusztowaniach. Analizy wykonywane na poziomie komórkowym i molekularnym – tj histochemia, immunohistochemia, ekspresja antygenów powierzchniowych z użyciem cytometrii przepływowej, analizy proliferacji, starzenia i programowanej śmierci komórek, oznaczanie aktywności wybranych enzymów, oznaczanie wskaźników różnicowania komórek, w tym analiza aktywacji i regulacji wybranych wewnątrzkomórkowych ścieżek sygnalizacyjnych.

Szkolenia z zakresu:

- izolacji i hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego ludzkich i gryzoni;

- hodowli 2D i 3D na niestandardowych, eksperymentalnych podłożach i rusztowaniach (hodowle na zróżnicowanych chemicznie i/lub topograficznie podłożach i rusztowaniach ceramicznych, metalowych, polimerowych);

- hodowli dynamicznych z zastosowaniem bioreaktora perfuzyjnego.

Obrazowanie komórek w mikroskopie świetlnym, konfokalnym i elektronowym;

Morfometryczna analiza obrazu;

Analiza ekspresji genów i białek;

Analiza procesów biologicznych i wpływu wybranych substancji chemicznych na te procesy, na modelu muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Stosowane metody i techniki badawcze:

• Mikroskopia elektronowa skaningowa w temperaturze pokojowej.

• Analiza składu i rozmieszczenia pierwiastków metodą mikrowiązki elektronowej z detekcją energii promieniowania X spektrometrią dyspersji energii.

• Cytometria przepływowa.

• Laserowa mikroskopia skaningowa (mikroskopia konfokalna).

• Przygotowanie tkanek do Mikroskopii Elektronowej Transmisyjnej w temperaturze pokojowej oraz techniką mrożeniową, AFS i UC7-Cryo.

• Obrazowanie ultrastruktury komórek (TEM, STEM w ciemnym i jasnym polu) oraz obrazowanie struktur komórkowych w przestrzeni 3D (Tomografia Elektronowa) z wykorzystaniem oprogramowania EM MENU 4.

• Dekonwolucja obrazu z użyciem oprogramowania Huygens Professional.

• Morfometryczna analiza obrazu z użyciem programu ImageJ.

• Techniki histologiczne i histochemiczne.

• Analiza ekspresji genów (Real-Time qPCR).

• Analiza ekspresji białek (Immunohistochemia – również immuno EM, Immunofluorescencja, Immunoprecypitacja na kulkach magnetycznych, Western Blotting).

• Hodowla mutantów i szczepów transgenicznych Drosophila melanogaster.

• Testy przeżywalności i testy behawioralne (np. poziom i wzór aktywności lokomotorycznej przy użyciu monitorów DAM) na modelu Drosophila melanogaster.

• Transfekcje i trasdukcje komórek ludzkich i gryzoni (przejściowe i trwałe modyfikacje genetyczne komórek).

Dodatkowe informacje:

• Pomiar liczebności zawiesin bakteryjnych przeznaczonych do produkcji szczepionek – Instytut Biotechnologii Surowic i Szczepionek BIOMED S.A., Kraków.

• Obrazowanie mikroskopią elektronową skaningową powierzchni zębowych z naniesionymi nanocząstkami srebra i złota – Dental Nanotechnology S.A., Katowice.

Kontakt: cittru@uj.edu.pl

_________________________________________________________________________________________________

Department of Biology and Cell Imaging

Faculty of Biology and Earth Sciences

Scientific research subjects:

• Searching for novel, accurate and precise correction methods for quantitative biological X-ray microanalysis. Teoretical solutions based on Monte Carlo simulation and their experimental verification.
• Investigation of osteoconductive and osteosteoinductive properties of implant materials in human and rodent mesenchymal stem cell and osteoprogenitor cultures – 2D and 3D cultures on experimental surfaces and scaffolds and dynamic cultures (i.e. cultures stimulated with dynamic media flow.

Potential application of scientific research:

• Precise and accurate elemental analysis of cells and tissues as well as other biologically-derived materials, polimers and matrices composed of light elements. Analysis of element distribution in materials mentioned above.
• Recognition of biological mechanisms initiated by osteogenic cells on contact with bioinert or bioactive materials; selection of materials with inherent properties promoting bone tissue regeneration.

Potential research services:

• Chemical or low-teperature preparation of biological materials and hydrated polimers for their examination by means of scanning electron microscopy.
• Low-teperature preparation of biological materials and hydrated polimers for element analysis by means of X-ray microbeam techniques.

Courses, trainings, workshops on:

- Preparation of biologically-derived materials for scanning electron microscopy imaging and examination.

- Preparation of biologically-derived materials for X-ray microanalysis.

- Preparation of standards dedicated to quantitative X-ray microanalysis of biological materials.

- Methods for quantitative analysis of elements by means of X-ray microanalysis in biology.

- Practical operation of the scanning electron microscope combined with energy-dispersive spectrometer for element analysis.

- Preparation of cells and their analysis using flow cytometry – apoptosis, presence of surface antigenes, DNA content, cell size.

- Practical operation of the flow cytometer.

- Preparation of cells and tissues to examinations using fluorescence microscopy (wide—field and confocal) – immunolabeling.

- Imaging of cells and tissues to wide-field and confocal microscopy imaging – application of deconvolution approaches as well as FRET and FRAP techniques.

• Analyses of osteogenic potential of mesenchymal stem cells and osteoprogenitor cells in 2D and 3D cultures grown on commercially available and experimental surfaces and scaffolds. Analyses at cell and molecular level – i.e. histochemical and immunohistochemical methods, surface antigen markers evaluated with cytofluorimetry, evaluation of cell proliferation, aging, apoptosis and related, analyses of enzymes activity, determination of differentiation markers, including analyses of selected intracellular signaling pathways – their activation and regulation. 

Workshops on:

- Isolation and culture of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.

- 2D and 3D cultures on non-standard, experimental surfaces and scaffolds made of ceramics, metals and polymers; chemically and topographically differentiated.

- Dynamic cultures with the use of perfusion bioreactor.

Methods and research techniques:

• Scanning electron microscopy at room temperature;
• Electron probe X-ray microanalysis of element content and distribution with energy-dispersive spectrometry;
• Flow cytometry;
• Scanning laser microscopy – confocal microscopy.

Contact: cittru@uj.edu.pl