Program komputerowy do analizy danych i wizualizacji wyników z metody RT-qPCR

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (ang. real time quantitative polymerase chain reaction, qPCR) to metoda analityczna szeroko stosowana zarówno w badaniach naukowych, jak i w diagnostyce. W tej metodzie poziom ekspresji badanych genów jest analizowany w odniesieniu do genu/genów referencyjnych, czyli takich, których poziom powinien być stały niezależnie od czynników środowiskowych, jakim podlega komórka, lub od jej stanu fizjologicznego. Istotnym wyzwaniemn metody qPCR jest właściwy wybór genów referencyjnych.

W opracowanym narzędziu stosuje się rozbicie grupy analizowanych próbek (model eksperymentalny) na szereg podmodeli składających się z mniejszej liczby próbek (minimalnie z dwóch), a następnie wytypowanie w każdym z tych modeli najlepszego genu referencyjnego z grupy analizowanych w danym eksperymencie potencjalnych genów referencyjnych, z wykorzystaniem znanego algorytmu Norm-Finder. Wytypowany w ten sposób gen lub para genów będących najlepszą referencją w danym modelu stanowi następnie podstawę do obliczenia ekspresji względnej genów badanych w poszczególnych modelach i przeprowadzenia walidacji spójności otrzymanych wyników.

W ramach każdego z modeli prowadzone są analizy statystyczne bazujące na odpowiednio dobranych testach, pokazujące istotności statystyczne różnic w ekspresji genu badanego w obrębie danego modelu. Kolejnym etapem jest porównanie spójności otrzymanych wyników/wartości i ich statystycznej istotności dla danego genu badanego w obrębie wszystkich badanych modeli. Program wyznacza tzw. coherence score (współczynnik spójności) opisujący poziom spójności otrzymanych wyników. Osiągnięcie niezadowalającej wartości tego współczynnika – poniżej akceptowalnej przez badacza – prowadzi do kolejnego etapu analizy, tj. ponownego wyboru genów referencyjnych we wszystkich badanych modelach, ale odbywa się on po uprzednim usunięciu z listy potencjalnych genów referencyjnych tego, który na poprzednim etapie uzyskał najsłabszy poziom stabilności.

Nowe rozwiązanie łączy w sobie funkcjonalności programów wyznaczających najlepsze geny referencyjne oraz programów typu arkusze kalkulacyjne, które pozwalają na analizę poziomu ekspresji genu badanego, analizę statystyczną i interpretację graficzną wyników.

Program pozwala na określenie rzeczywistego poziomu ekspresji genów badanych i prawidłową interpretację biologiczną wyników. Umożliwia jednoczesną i niezależną analizę wielu genów badanych.

Opisywane rozwiązanie jest przedmiotem zgłoszenia patentowego. Centrum Transferu Technologii CITTRU UJ poszukuje podmiotów zainteresowanych współpracą przy wdrażaniu tego wynalazku.

Szczegółowej informacji w sprawie udzieli:

dr Renata Bartoszewicz               tel. +48 12 663 42 08,  kom. 515 493 518

Broker technologii                        e-mail: renata.bartoszewicz@uj.edu.pl

Uniwersytet Jagielloński

Centrum Transferu Technologii CITTRU

www.cittru.uj.edu.pl

The computer program for data analysis and visualization of results from the RT-qPCR method

Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) is an analytical method widely used in research and diagnostics. In this method, the expression level of the target gene is calculated in relation to the reference gene/genes which are selected for its almost constant level of expression regardless of environmental factors to which the cell is subjected or its physiological state. Choosing the appropriate reference genes is crucial for the gene expression analysis and at the same time a limitation of the qPCR method.

In the developed tool, the group of analyzed samples (an experimental model) is divided into several sub-models consisting of a smaller number of samples (at least two samples) and then in each of these models, the best reference gene/pair of genes is selected from the group of potential reference genes using the NormFinder algorithm. The selected gene or pairs of genes being the best reference in a given model constitute the basis for further stages of the analysis, i.e. validation of the trend of target gene expression among particular samples.

Within each model, statistical analyzes are carried out based on appropriately selected tests, showing significant statistical differences in target gene expression between given samples across individual models. The next step is to compare the consistency of the obtained results/values including statistics

for a given target gene within all tested models. The developed program sets the so-called coherence score describing the level of consistency of the obtained results. Achieving an unsatisfactory value of this coefficient - below the value acceptable by the researcher - leads to the next stage analysis, i.e. removal of the potential reference gene with the weakest stability value in each model, re-selection of the reference gene/pair of genes and re-validation of the results in all tested models.

The developed tool combines the functionalities of programs selecting the best reference genes, and spreadsheet programs, allowing for an analysis of the expression level of the target gene, statistical analysis, and graphic interpretation of the results.

The program allows for the estimation of the real level of expression of the genes tested and enables for correct biological interpretation of the results. It enables the simultaneous, independent analysis of many target genes. The presented tool is the subject of the patent application. Technology Transfer Center CITTRU UJ is looking for entities interested in cooperation in the commercialization of the invention.

For detailed information please contact:

Renata Bartoszewicz, Ph.D.                      phone: +48 12 664 42 08, 515 493 518

Technology Transfer Officer                      e-mail: renata.bartoszewicz@uj.edu.pl

Jagiellonian University

Centre for Technology Transfer CITTRU

www.cittru.uj.edu.pl

This project is co-financed by the Innovation Incubator 4.0 project funded by the Ministry of Science and Higher Education (POIR 2014-2020).