Od szkiełka i oka do najnowocześniejszych technik mikroskopowych
Mikroskopia jest dziedziną z niezwykle bogatą przeszłością – ludzie od wieków pasjonowali się możliwością oglądania obrazów niewidocznych bez użycia odpowiedniego sprzętu. Odkrycie elektronów w 1897 r. pozwoliło na oglądanie pojedynczych atomów, a tym samym umożliwiło powstanie dających niesamowite powiększenia mikroskopów elektronowych, natomiast zastosowanie barwników fluorescencyjnych dało z kolei możliwość wizualizacji – często przezroczystych dla światła widzialnego – obiektów biologicznych. Odkrycia te stanowią kamienie milowe w rozwoju technologii mikroskopowych, które do dziś odgrywają niepodważalną rolę w naukach biologicznych – SEM oraz CLSM.

Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)
W 1935 r. niemiecki fizyk Max Knoll przedstawił w artykule naukowym pomysł na zbudowanie mikroskopu, który – w celu uzyskania obrazu powierzchni badanej próbki – miał wykorzystywać skanującą wiązkę elektronów. Skaningowa mikroskopia elektronowa (ang. scanning electron microscopy – SEM), bo o niej mowa, pozwala na analizę powierzchni próbki, ocenę morfologii oraz kształtu mikrostruktur materiałów biologicznych w dużym powiększeniu.

Wiązka elektronów, skanując powierzchnię próbki, uwalnia z niej sygnały elektronowe, które następnie – po przetworzeniu – dają trójwymiarowy obraz preparatu. Ten rodzaj mikroskopii znalazł też swoje zastosowanie w inżynierii materiałowej i metalurgii.

Podstawowym wymaganiem stawianym próbkom do analizy za pomocą SEM jest zdolność przewodzenia prądu, zatem w przypadku próbek organicznych – przewodzących prąd słabo lub w ogóle – wymagane jest specjalne przygotowanie preparatu. Co więcej, obiekty biologiczne o wysokim stopniu uwodnienia (np. tkanki roślinne i zwierzęce, preparaty mikrobiologiczne) muszą być analizowane w warunkach regulowanej próżni – w zakresie od 1 do 270 Pa, w przeciwnym razie mogłyby stać się źródłem par i spowodować uszkodzenie mikroskopu.

Przygotowanie próbek do obserwacji w SEM obejmuje: (1) utrwalanie w aldehydzie glutarowym, (2) płukanie w buforze fosforanowym, (3) osmowanie, (4) odwadnianie, (5) suszenie w punkcie krytycznym (CPD) oraz (6) napylanie próbek metalem szlachetnym.

Suszenie techniką CPD opiera się na wykorzystaniu zjawiska polegającego na tym, że w określonych warunkach, czyli w tzw. punkcie krytycznym, dwutlenek węgla przechodzi ze stanu płynnego w gazowy, a procesowi temu nie towarzyszą siły zniekształcające. Metoda ta pozwala zatem wysuszyć materiał biologiczny bez jego deformacji – w ten sposób uzyskuje się mniej artefaktów na powierzchni badanych próbek. Niestety źródłem niepożądanych artefaktów może być pierwszy etap przygotowywania preparatu, czyli utrwalanie próbek w aldehydzie glutarowym, który często powoduje zmianę struktury próbki. Twarde obiekty biologiczne, np. zarodniki roślin, ziarna pyłku, nasiona, pokrywy chitynowe skorupiaków czy aparaty gębowe owadów, nie zmieniają swojej naturalnej struktury w warunkach próżni mikroskopowej, zatem nie muszą być specjalnie przygotowywane.

Na czym polega mikroskopia konfokalna?
Choć idea mikroskopu konfokalnego pojawiła się już w latach 50. ubiegłego wieku, a podstawy obrazowania zostały opatentowane przez Marvina Minsky'ego w 1961 r., urządzenie to stało się komercyjnie dostępne dopiero na początku lat 80.

Technika skaningowej laserowej mikroskopii konfokalnej (ang. confocal laser scanning microscopy, CLSM) jest nowoczesną odmianą mikroskopii fluorescencyjnej, jednak charakteryzującą się lepszą rozdzielczością i kontrastem, w porównaniu do zwykłych mikroskopów fluorescencyjnych.

Obraz uzyskiwany jest poprzez skanowanie powierzchni preparatu laserem, który wzbudza fluorescencję barwnika. Istnieje ponadto możliwość obserwacji warstw leżących w głębszych warstwach preparatu.

W mikroskopii konfokalnej preparaty wybarwia się, stosując barwniki, zawierające odpowiedni fluorochrom wiążący się z reaktywnymi grupami. Do najpopularniejszych barwników fluorescencyjnych zaliczamy związki, takie jak:

• Barwniki SYTO – do wybarwiania kwasów nukleinowych, a także znakowania żywych i martwych komórek,
• Fluoresceina (FITC) – do wybarwiania białek i aminocukrów,
• Konkanawalina A (conA) – do wybarwiania węglowodanów.

Którą technikę wybrać dla naszego preparatu?
Odpowiedź na to pytanie będzie zależała w dużej mierze od stopnia uwodnienia naszej próbki oraz tego, jak dużą rozdzielczość będziemy chcieli uzyskać. Możliwość wizualizacji uwodnionych preparatów jest szczególnie istotna w przypadku badań nad biofilmem bakteryjnym, w którym komórki drobnoustrojów żyją w matrycy złożonej głównie z wydzielanych pozakomórkowo substancji polimerycznych (ang. extracellular polymeric substances, EPS). Ponieważ niemożliwe jest rozdzielenie biofilmu na warstwy bez jego zniszczenia, a więc zakłócenia naturalnej struktury i stosunku ilości bakterii martwych do bakterii żywych, ocena skutków działania substancji antybakteryjnej w głębszych warstwach jest utrudniona. W tej sytuacji mikroskop konfokalny jest niezastąpionym narzędziem, ze względu na możliwość obrazowania głębszych warstw preparatu, bez konieczności jego destrukcji.

Dzięki tej technice można identyfikować i określać dystrybucję komórek czy składników macierzy biofimu. Niestety w porównaniu do SEM, CLSM wciąż charakteryzuje się gorszą rozdzielczością.