Fot. Przykład chromatogramu cieczowego złożonej mieszaniny (perfum)

Przyczyny degradacji złoża w kolumnach chromatograficznych

Konieczność analizowania różnej gamy substancji na jednej kolumnie, w zmiennych warunkach przepływu fazy ruchomej oraz ciśnienia i temperatury, powoduje, że jej złoże ulega degradacji. Szczególnie niepożądane są zanieczyszczenia mechaniczne, które często gromadzą się na wejściu do kolumny i tam się zatrzymują. Możliwe jest ich usunięcie, poprzez wypłukanie z wykorzystaniem rozpuszczalnika o dużej sile elucji, np. acetonitrylu lub metanolu, jednak takie rozwiązanie może doprowadzić do pewnych zmian w zdolności rozdzielczej kolumny.

Inne przyczyny krótszej żywotności kolumn chromatograficznych:

* niedokładne zamykanie jej końców, gdy kończy się analizę; odparowanie rozpuszczalnika powoduje, że pomiędzy ziarnami złoża następuje wykrystalizowanie składników, np. stosowanych wcześniej buforów;

* stosowanie eluentów o wartości pH, niekorzystnie wpływającej na złoże kolumny;

* częste analizy rozdzielania składników, takich jak kwasy tłuszczowe (są silnie zatrzymywane na fazach stacjonarnych);

* niedokładne wymycie buforów, stosowanych jako fazy ruchome (często jest przyczyną wykrystalizowania resztek soli na złożu);

* zatrzymywanie przez złoże związków, takich jak białka resztkowe, znajdujące się w próbce w wyniku jej niedostatecznego oczyszczenia;

* pomijanie filtrowania zarówno faz ruchomych, jak i próbek do analizy, przed rozdzieleniem chromatograficznym.

Stosowanie przedkolumny w analizach chromatograficznych

Oprócz kolumny chromatograficznej, na której zachodzi właściwe rozdzielenie składników mieszaniny pierwotnej, stosunkowo często stosowana jest tzw. przedkolumna. Umieszczana jest pomiędzy dozownikiem a właściwą kolumną analityczną. Jej głównym zadaniem jest zapobieganie przedostawania się zanieczyszczeń mechanicznych na złoże. Ponadto chroni przed osadzaniem substancji, nierozpuszczalnych w fazie ruchomej oraz trudno eluujących w danych warunkach. Stosowanie przedkolumny pomaga także w odpowiednim nasyceniu fazą ruchomą złoża kolumny. Umożliwia to ochronę fazy stacjonarnej przed degradacją w przypadku używania rozpuszczalników o dużej sile elucji. Pomimo znacznie wyższej ceny przedkolumny, w stosunku do klasycznej kolumny chromatograficznej, nie warto pomijać tego elementu wyposażenia aparatu do HPLC.

W idealnej sytuacji kolumna ochronna (przedkolumna) powinna zawierać takie samo złoże, co właściwa kolumna analityczna. W niektórych przypadkach można zastosować zbliżone wypełnienie. Należy jednak pamiętać, że taki zabieg nie może wpłynąć na wynik rozdzielenia chromatograficznego analizowanych substancji. Wymiary kolumny ochronnej różnią się znacznie w stosunku do kolumny właściwej. Średnicę zachowuje się taką samą lub nieznacznie mniejszą. Jej długość jest natomiast mniejsza w stosunku do klasycznych kolumn w HPLC i wynosi od 1 do 5 cm (zaleca się, aby długość była możliwie jak najmniejsza, co zapobiega powstawaniu tzw. objętości martwych kolumny, jednak musi być na tyle długa, żeby skutecznie zatrzymać zanieczyszczenia). Zazwyczaj jest to długość 2 cm, a średnica wewnętrzna wynosi 4,6 mm. Ziarna wypełnienia przedkolumn mają średnicę ok. 40 μm. Takie rozwiązanie pozwala uzyskać znikome spadki ciśnienia, dzięki czemu nie zostaje zaburzony rozdział analityczny. Większość kolumn ochronnych dobrze sprawdza się w szerokim zakresie pH – zwykle od 1,0 do 7,0, czasami nawet do 10,0. Kolumny ochronne zbudowane są zazwyczaj ze stali nierdzewnej.

Inną opcją zabezpieczenia kolumny HPLC przed degradacją złoża jest zastosowanie filtrów liniowych. Mogą pracować pod ciśnieniem nawet ponad 1000 barów. Zapewniają minimalne objętości martwe na kolumnach dzięki niewielkim otworom. Długości filtrów liniowych są podobne, jak w przypadku kolumn ochronnych i wynoszą zazwyczaj do 5 cm. Spełniają analogiczne funkcje, co przedkolumny.