Metody badania właściwości przeciwutleniających można podzielić na dwie kategorie:
- uwzględniające redukcje jonów przejściowych, np.
- FRAP (z ang. Ferric Ion Reducting Antioxidant Parameter), oznaczająca poziom zredukowanych jonów żelaza Fe3+ → Fe2+,
- CUPRAC (z ang. Cupric Ion Reducting Antioxidant Capacity), wyznaczająca ilość zredukowanych jonów miedzi Cu2+ → Cu1+.
- wymiatające stabilne rodniki, np.
- ABTS•+, z wykorzystaniem rodnika soli amonowej kwasu 2,2-azino-bis(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowego),
- DPPH•, przy użyciu rodnika 1,1-difenylo-2-pikrylohydrazylowego.
Najczęściej do badań wykorzystuje się techniki spektroskopowe, bazujące na kolorymetrii, fluorescencji i luminescencji. Istnieją również inne metody, pozwalające wykorzystać elektrochemię układu, do których zaliczamy: woltamperometrie, amperometrię oraz biamperometrię.
W badaniach in vitro, nieprowadzonych w organizmie żywym, wykorzystuje się dwa mechanizmy dezaktywacji wolnych rodników, na podstawie których wyznacza się właściwości antyoksydacyjne:
- HAT (z ang. Hydrogen Atom Transfer) – mechanizm przeniesienia atomu wodoru, do którego zaliczamy metody:
- ORAC – zdolność pochłaniania RFT przez antyoksydanty w próbkach biologicznych,
- LPIC – oznaczanie inhibicji utleniania LDL cholesterolu,
- TRAP – całkowita zdolność wymiatania wolnych rodników,
- IOC – oznaczanie inhibicji poboru tlenu,
- SASA – poziom redukcji rodników nadtlenkowych za pomocą alkaliów.
- SET (z ang. Single Electron Transfer) – mechanizm przeniesienia pojedynczego elektronu, do którego zaliczamy:
- TEAC – potencjał antyoksydacyjny w równoważnikach troloksu,
- FRAP – zdolność do redukcji jonów żelaza,
- DPPH – całkowita inhibicja rodników,
- ABTS – wymiatanie wolnych rodników,
- CUPRAC – zdolność do redukcji jonów miedzi,
- Folin-Cicalteu – ogólna zawartość polifenoli.
Jedną z najpowszechniej stosowanych jest metoda TEAC, uwzględniająca równoważniki troloksu. Troloks, czyli kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy, jest bardzo reaktywną pochodną witaminy E. Jego właściwości antyoksydacyjne są wynikiem obecności ugrupowania 6-chromanolowego. W tej metodzie służy jako wzorzec odniesienia aktywności przeciwutleniającej dla badanych substancji.
Jako roztworu, imitującego reaktywne formy tlenu, używa się zazwyczaj metanolowego roztworu rodników DPPH•. Jest on bardzo dobrze rozpuszczalny w alkoholu, relatywnie stabilny podczas czynności przygotowawczych oraz pozwala na zastosowanie prostej techniki pomiarowej, wykorzystującej spektrofotometrię UV-Vis. Początkowy roztwór rodników DPPH• ma zabarwienie ciemnofioletowe, jednak wraz z redukcją zmienia się na żółte.
Z kolei jedna z metod opartych na mechanizmie HAT, czyli ORAC (z ang. Oxygen Radical Absorbance Capacity), polega na pomiarze spadku intensywności fluorescencji. W obecności przeciwutleniacza dochodzi bowiem do tego zjawiska, gdy sonda molekularna, np. fluoresceina, utlenia się pod wpływem indukowanych termicznie reaktywnych form tlenu, będących przedstawicielami wolnych rodników. Inna z nich, LPIC, również wykorzystuje sondę fluorescencyjną, ale oznaczeniu podlegają zdolności antyoksydantów do jej ochrony przed szkodliwym działaniem RFT. Taka lipofilowa sonda, C11-BODIPY, jest wbudowana w błonę komórkową.
KOMENTARZE