Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Metody stosowane w badaniu właściwości antyoksydacyjnych
Metody stosowane w badaniu właściwości antyoksydacyjnych

Ponieważ budowa białek, kwasów nukleinowych oraz polisacharydów często jest bardzo złożona, wszelkie badania ich reakcji są skomplikowane. Zależą one m.in. od rzędowości ich struktury. Badania wielkości stresu oksydacyjnego muszą obejmować sumaryczną wartość potencjału antyoksydacyjnego wszystkich składników o takiej aktywności. Czasami stosuje się również oznaczanie tylko jednego składnika, posiadającego zdolności antyoksydacyjne.

 

Metody badania właściwości przeciwutleniających można podzielić na dwie kategorie:

  1. uwzględniające redukcje jonów przejściowych, np.
  • FRAP (z ang. Ferric Ion Reducting Antioxidant Parameter), oznaczająca poziom zredukowanych jonów żelaza Fe3+ → Fe2+,
  • CUPRAC (z ang. Cupric Ion Reducting Antioxidant Capacity), wyznaczająca ilość zredukowanych jonów miedzi Cu2+ → Cu1+.
  1. wymiatające stabilne rodniki, np.
  • ABTS•+, z wykorzystaniem rodnika soli amonowej kwasu 2,2-azino-bis(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowego),
  • DPPH, przy użyciu rodnika 1,1-difenylo-2-pikrylohydrazylowego.

Najczęściej do badań wykorzystuje się techniki spektroskopowe, bazujące na kolorymetrii, fluorescencji i luminescencji. Istnieją również inne metody, pozwalające wykorzystać elektrochemię układu, do których zaliczamy: woltamperometrie, amperometrię oraz biamperometrię.

W badaniach in vitro, nieprowadzonych w organizmie żywym, wykorzystuje się dwa mechanizmy dezaktywacji wolnych rodników, na podstawie których wyznacza się właściwości antyoksydacyjne:

  1. HAT (z ang. Hydrogen Atom Transfer) – mechanizm przeniesienia atomu wodoru, do którego zaliczamy metody:
  • ORAC – zdolność pochłaniania RFT przez antyoksydanty w próbkach biologicznych,
  • LPIC – oznaczanie inhibicji utleniania LDL cholesterolu,
  • TRAP – całkowita zdolność wymiatania wolnych rodników,
  • IOC – oznaczanie inhibicji poboru tlenu,
  • SASA – poziom redukcji rodników nadtlenkowych za pomocą alkaliów.
  1. SET (z ang. Single Electron Transfer) – mechanizm przeniesienia pojedynczego elektronu, do którego zaliczamy:
  • TEAC – potencjał antyoksydacyjny w równoważnikach troloksu,
  • FRAP – zdolność do redukcji jonów żelaza,
  • DPPH – całkowita inhibicja rodników,
  • ABTS – wymiatanie wolnych rodników,
  • CUPRAC – zdolność do redukcji jonów miedzi,
  • Folin-Cicalteu – ogólna zawartość polifenoli.

Jedną z najpowszechniej stosowanych jest metoda TEAC, uwzględniająca równoważniki troloksu. Troloks, czyli kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy, jest bardzo reaktywną pochodną witaminy E. Jego właściwości antyoksydacyjne są wynikiem obecności ugrupowania 6-chromanolowego. W tej metodzie służy jako wzorzec odniesienia aktywności przeciwutleniającej dla badanych substancji.

Jako roztworu, imitującego reaktywne formy tlenu, używa się zazwyczaj metanolowego roztworu rodników DPPH. Jest on bardzo dobrze rozpuszczalny w alkoholu, relatywnie stabilny podczas czynności przygotowawczych oraz pozwala na zastosowanie prostej techniki pomiarowej, wykorzystującej spektrofotometrię UV-Vis. Początkowy roztwór rodników DPPH ma zabarwienie ciemnofioletowe, jednak wraz z redukcją zmienia się na żółte. 

Z kolei jedna z metod opartych na mechanizmie HAT, czyli ORAC (z ang. Oxygen Radical Absorbance Capacity), polega na pomiarze spadku intensywności fluorescencji. W obecności przeciwutleniacza dochodzi bowiem do tego zjawiska, gdy sonda molekularna, np. fluoresceina, utlenia się pod wpływem indukowanych termicznie reaktywnych form tlenu, będących przedstawicielami wolnych rodników. Inna z nich, LPIC, również wykorzystuje sondę fluorescencyjną, ale oznaczeniu podlegają zdolności antyoksydantów do jej ochrony przed szkodliwym działaniem RFT. Taka lipofilowa sonda, C11-BODIPY, jest wbudowana w błonę komórkową.

Źródła

Fot. https://www.pexels.com/pl-pl/zdjecie/naukowiec-w-laboratorium-3735709/

H.A. Moharram, M.M. Youssef, Methods for determining the antioxidant activity: a review, Alexandria Journal of Food Science and Technology (2014) 11 (1): 31-42. 

M.Cybul, R.Nowak, Przegląd metod stosowanych w analizie właściwości antyoksydacyjnych wyciągów roślinnych, Herba Polonica Journal (2008) 54 (1): 68-78. 

A.M Pisoschi, G.P Negulescu, Methods for Total Antioxidant Activity Determination: A Review, Biochemistry & Analytical Biochemistry (2011) 1 (1): 2-10.

KOMENTARZE
Newsletter