To tylko niektóre z pytań, które stają na drodze wyboru wielofunkcyjnego czytnika mikropłytek dedykowanego do pomiarów absorbancji, luminescencji i fluorescencji. Większość aktualnie dostępnych na rynku tego typu urządzeń oferuje powyżej wymienione technologie pomiarowe uzupełnione dodatkowo o testy m.in. FP (fluorescencja polaryzacyjna), TRF (fluorescencję czasu zaniku albo fluorescencję czasowo-rozdzielczą), FRET (fluorescencja z rezonansowym przekazywaniem energii), TR-FRET (czasowo rozdzielczą fluorescencję z rezonansowym przekazywaniem energii transfer energii) np. hTRF® CisBio (homogeniczny TRF) dla pomiarów fluorescencji oraz BRET (luminescencja dwubarwna) dla luminescencji. Warto zwrócić jednak uwagę, że rezultat powyżej wymienionych testów w większości będzie zależał od najnowocześniejszych technologii zastosowanych w czytnikach mikropłytek oraz pewnej kombinacji modułów, w które wyposażony jest każdy taki system, m.in. monochromatora lub filtrów optycznych, rodzaju i ilości detektorów, źródła światła oraz dostępności luster dichroicznych dla fluoroforów z wąskim widmem wzbudzenia i emisji.

Większość aktualnie dostępnych czytników mikropłytek działa w oparciu o monochromatory oparte na siatce dyfrakcyjnej, podwójne monochromatory oraz monochromatory LVF (jeden dla wzbudzenia i drugi dla emisji). Jak wiadomo, zastosowanie monochromatorów zapewnia czytnikowi dużą uniwersalność, ponieważ użytkownik może wybrać praktycznie dowolną długość fali pomiarowej w określonym zakresie, w którym mierzy monochromator.

Trzeba jednak mieć na uwadze, że stosując monochromatory (zjawisko dyfrakcji i interferencji), nie osiągniemy tak wysokiej czułości i dokładności pomiarów jak dla czytników wyposażonych w filtry optyczne, które posiadają najwyższą przepuszczalność światła (ponad 80%). Zastosowanie filtrów optycznych i ich niesamowita przewaga nad monochromatorami ma istotne znaczenie głównie przy wykonywaniu wyjątkowo czułych testów tj. TRF, TR-FRET, hTRF® oraz AlphaScreen®, AlphaLISA®. Okazuje się, że tradycyjne testy przeprowadzane w trybie TRF są niejednorodne (wymagają wielu etapów płukania i inkubacji) oraz wykorzystują m.in. lantanowce (metale ziem rzadkich) jako donory energii w FRET, np. kryptat Eu (europu) lub Tb (terbium). Ceny za tego rodzaju odczynniki są dosyć wysokie, a osobie wykonującej takie testy często zależy na otrzymaniu jak najlepszych wyników przy jednoczesnej oszczędności zużycia powyższych substancji. W przypadku takich pomiarów z użyciem Eu i Tb najczęściej stosuje się filtry wzbudzeniowe 320 nm lub 330 nm oraz emisyjne 616 nm, 620 nm, 665 nm, bo tylko wtedy jesteśmy w stanie osiągnąć satysfakcjonujące rezultaty. Jeśli już zdecydujemy się na wybór czytnika wyposażonego w filtry optyczne, to warto zwrócić uwagę przy zakupie takiego sprzętu na ilość i rodzaj dostępnych filtrów w pakiecie podstawowym oraz na czułość, jaką osiąga urządzenie w trybie TRF z kryptatem Eu lub Tb.

Większość aktualnie dostępnych tego rodzaju urządzeń na rynku niestety oferuje niewielką ilość filtrów (najczęściej od 4 do 8), niekoniecznie dostosowanych do technologii pomiarowych, które obsługuje sprzęt. Dodatkowo czasami okazuje się, że filtry optyczne dołączone do sprzętu są mało uniwersalne, a dokupienie kolejnych jest bardzo kosztowne i nieopłacalne z punktu widzenia użytkownika. Jednak istnieją firmy, które oferują pełen zestaw 11 filtrów optycznych dedykowanych do wszystkich technologii pomiarowych, które wystarczy raz zainstalować wewnątrz urządzenia na 32 pozycyjnej automatycznej zmieniarce filtrów (bez konieczności ich ręcznej wymiany). Kolejnym dosyć istotnym punktem jest oprogramowanie obsługujące czytnik. Najczęściej w pakiecie producenci oferują podstawową wersję programu do sterowania urządzeniem bez zaawansowanych funkcji do analizy wyników, tj.: wyznaczanie współczynnika absorbancji (OD) wraz z wyliczeniem średniej wartości absorbancji, wyznaczenie współczynnika FRET, dopasowanie krzywej standardowej (liniowa, logarytmiczna, eksponencjalna, wielomian 2 i 3 stopnia, dopasowanie 4 i 5 parametro we, punkt-punkt, krzywe sklejane), obliczanie parametrów kinetycznej reakcji enzymatycznej (Vmax i Kmax) z użyciem równań Michaelisa-Mantena z możliwością eksportu wykresów i parametrów do pliku xlsx i txt. Takie dodatkowe oprogramowanie pozwalające na opracowanie uzyskanych wyników często jest dodatkowo płatne oraz dosyć skomplikowane i mało intuicyjne dla użytkownika. Warto też w tym punkcie zwrócić uwagę, czy program do obsługi czytnika bezproblemowo będzie pracował, zgodnie z wymaganiami 21 CFR part 11 dla środowisk GMP. Nawet jeśli aktualnie laboratorium nie pracuje w reżimie GMP, to niewykluczone, że taka zmiana w przyszłości będzie miała miejsce. Większość dostępnych na rynku czytników posiada możliwość zamontowania dyspensera lub dwóch do dozowania reagentów w trakcie wykonywania pomiarów, różne tryby mieszania czy wytrząsania płytek, a także inkubację w temperaturach od +2 °C ponad temperaturę otoczenia do +42 °C (niektóre aż do +65 °C) z opcją kontroli i regulacji stężenia CO2/O2. Mniej modeli oferuje możliwość zamontowania drugiego detektora, który umożliwia bezpośredni, wysokoczuły pomiar luminescencji, a także pomiary znaczników alfa, beta i gamma w trybie ciekłoscyntylacyjnym. Do większości czytników można także dokupić automatyczny zmieniacz płytek-stacker z czytnikiem kodów kreskowych, który zdecydowanie ułatwia wykonywanie dużej ilości analiz – także bez nadzoru ze strony obsługi. Jeśli komputer z oprogramowaniem czytnika podłączony jest do sieci internetowej, wyniki działania takiego automatu można sprawdzić z dowolnego miejsca.

Zastosowanie

Podsumowując powyższe rozważania na temat dostępnych aktualnie na rynku wielofunkcyjnych czytników mikropłytek, wydaje się, że najlepszym rozwiązaniem dla laboratoriów prowadzących badania, m.in. nad nowymi lekami, szczepionkami, biomarkerami itd., są czytniki mikropłytek oparte na technologii filtrów optycznych. Z tak wyposażonym czytnikiem można osiągnąć czułość w trybie TRF na poziomie 10 fM Eu i wykonywać m.in.:

• testy AlphaScreen® Omnibeads,
• testy AlphaScreen® P-Tyr-100 (czułość < 100 amol),
• badania fosforylacji białek oraz szlaków przekazywania sygnałów pomiędzy białkami (AlphaScreen®),
• analizy TRF, TR-FRET, hTRF®, DELFIA®,
• testy AlphaLISA® – badanie aktywności białka troponiny T oraz jego interakcji z tropomiozyną w komórkach mięśnia sercowego,
• wykrywanie jonów metali Cu, Ni, Co, Fe, Zn w związkach kompleksowych wraz z pomiarem widm absorbancji, 
• pomiary reportera genów: GFP, YFP, lucyferaza, podwójna lucyferaza, BRET z sekwencyjnym pomiarem podwójnej emisji,
• badania bioluminescencji i radioaktywności genetycznie modyfikowanych komórek bakteryjnych,
• aktywność enzymów: proteazy, kaspazy, rozszczepienie substratów,
• badania oddziaływań białek w tym receptorów związanych z białkami G, oznaczenia ELISA, znakowanie komórek bakteryjnych, nowotworowych, macierzystych i wiele innych.

Autor:
Karolina Pawłocik
IRtech

----------------------------------------------------------------

Artykuł pochodzi z najnowszego wydania kwartalnika Biotechnologia.pl nr 4/2019.
Cały kwartalnik dostępny jest TUTAJ