Metoda BD CBA Flex Set System stanowi doskonalą alternatywę dla dotychczas stosowanych testów do pomiaru stężenia białek rozpuszczalnych - jest szybka, wydajna i pozwala na wykrycie białek w stężeniu nawet poniżej 0,5 pg/ml. Ważne również jest to, że w tej metodzie sami możemy komponować zestawy antygenów, które będziemy analizować zgodnie z naszymi potrzebami. Lista dostępnych zestawów jest duża i ciągle rośnie, obecnie zawiera zestawy specyficzne dla ludzkich, mysich i szczurzych cytokin, białek sygnalizacyjnych oraz immunoglobulin. Metoda ta pozwala na jednoczesną analizę kilkudziesięciu rozpuszczalnych antygenów w jednej próbce (25-50µl), co minimalizuje ilość materiału potrzebnego do analizy. Do testów ELISA lub hybrydyzacji Western używa się podobnych objętości, z tym że taka sama objętość potrzebna jest do analizy każdego białka oddzielnie. Jest to szczególnie uciążliwe (lub nawet niemożliwe), gdy mamy bardzo ograniczoną ilość materiału, np. gdy chcemy zanalizować supernatant z hodowli rzadkich komórek.





Procedura

Procedura nie jest zbyt skomplikowana i wykonanie całego testu, od początku do końca, zajmuje tylko jeden dzień. Dostępne zestawy pozwalają na analizę 100 próbek jednocześnie, niezależnie od ilości badanych antygenów. Do wykonania analizy dodatkowo trzeba dokupić tylko zestaw buforów, który dostępny jest w dwóch opcjach – na 100 i na 500 prób. Zestawy te są kompatybilne z większością cytometrów posiadających laser 488 nm lub 552 nm oraz niektórymi czytnikami płytek wielodołkowych.



Do próbki (surowicy, supernatantu z hodowli itp.) dodaje się kulki opłaszczone przeciwciałami (Captured beads) rozpoznającymi badane białko oraz przeciwciała reporterowe (Reporter antibodies) sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym - PE. Oba typy przeciwciał są specyficzne dla innych epitopów badanej molekuły. Kulki, przeciwciała reporterowe i białko tworzą razem złożony kompleks – Sandwich complex.


Każda populacja opłaszczonych kulek stanowi odrębną populację o specyficznej fluorescencji i ma swoją, ściśle zdefiniowaną pozycję alfanumeryczną, co umożliwia odróżnienie odmiennych populacji kulek. Dzięki temu możliwe jest mieszanie różnych ich typów i tworzenie złożonych testów w celu analizy wielu białek w jednej próbie.



Fluorescencja przeciwciał reporterowych pozwala na określenie poziomu danego białka w próbie i jest wprost proporcjonalna do jego stężenia.
Poniżej pokazano wykresy z przykładowego eksperymentu, gdzie analizowano cztery różne cytokiny w surowicy krwi. W bramce P1 znajdują się wszystkie populacje „Sandwich complex” scharakteryzowane na podstawie wielkości (parametry SSC/FSC). Na drugim wykresie rozdzielono populacje (bramki P2, P3, P4, P5) ze względu na fluorescencję opłaszczonych kulek. Wyselekcjonowano cztery populacje kulek specyficzne dla czterech analizowanych cytokin.



Następnie dla każdej populacji oddzielnie oznaczano fluorescencję barwnika sprzężonego z przeciwciałami reporterowymi. Umożliwiło to ocenę stężenia badanych białek.



Po analizie prób w cytometrze przepływowym, dane są analizowane przez program FCAP Array Software, który przedstawia wyniki w formie tabel i wykresów. Stężenie białek podawane jest w postaci łatwych do interpretacji jednostek - pg/ml.
    Jednocześnie z próbami do analizy, przygotowuje się metodą seryjnych rozcieńczeń standardy – czyli próby o określonym stężeniu białka. Są one poddawane takiej samej procedurze barwienia jak badane próby.


Analiza tych seryjnych rozcieńczeń pozwala na wykreślenie krzywej wzorcowej, według której są wykonywane obliczenia stężeń w badanych próbach. Poniżej pokazano przykładową krzywą wzorcową.



Oprac.: Magdalena Szaryńska