Western-blot jest metodą stosowaną w biologii molekularnej do detekcji różnego rodzaju białek. W celu identyfikacji w pierwszym etapie stosuje się elektroforetyczny rozdział białek zdenaturowanych według ich mas cząsteczkowych lub natywnych (niezdenaturowanych) zgodnie z ich strukturą trzeciorzędową. Elektroforezę przeprowadza się w żelach poliakrylamidowych, o procentowości dobranej odpowiednio do masy cząsteczkowej badanego białka. Obecność białek można sprawdzić wybarwiając żel poliakrylamidowy po elektroforezie za pomocą barwników takich jak czerń amidowa, Ponceau S, Coomassie Brilliant Blue lub metodą wysrebrzania. Jeśli nie stosuje się wybarwiana, to w następnym etapie mieszaninę rozdzielonych białek przenosi się w polu elektrycznym (transfer) na membrany nitrocelulozowe lub PVDF. Obecność białek w badanym materiale jest potwierdzana za pomocą swoistych przeciwciał, monoklonalnych lub poliklonalnych. Przed dodaniem przeciwciał membrana musi zostać „zablokowana” w roztworze innych białek, które łączą się z miejscami, z którymi nie jest związane badane białko. W tym celu stosuje się najczęściej roztwór odtłuszczonego mleka w proszku, rzadziej surowicy bydlęcej (BSA) lub albuminy, zazwyczaj z dodatkiem detergentu np. Tween20, w celu uniemożliwienia niespecyficznego łączenia się przeciwciał z membraną. W metodzie tej można stosować jeden rodzaj przeciwciał połączonych ze znacznikiem (metoda bezpośrednia) lub dwóch rodzajów przeciwciał – pierwszorzędowego niewyznakowanego, skierowanego swoiście przeciwko wykrywanemu białku oraz drugorzędowego wyznakowanego, skierowanemu swoiście przeciwko danemu izotypowi immunoglobulin (metoda pośrednia). Przeciwciała są zwykle wyznakowane enzymem np. peroksydaza chrzanowa lub fosfatazą alkaliczną, fluorochromem lub izotopem radioaktywnym. W przypadku znakowania enzymem używa się substratów dających barwny, nierozpuszczalny produkt osadzający się na membranie lub chemiluminescencję. W przypadku stosowania techniki chemiluminescencji obraz otrzymuje się, podobnie jak przy zastosowaniu radioizotopów, poprzez przyłożenie do membrany kliszy fotograficznej. Można również stosować urządzenia pozwalające na odczyt chemiluminescencji.


ETAPY:

1. Przygotowanie materiału do badań

Materiałem do badań może być dowolny materiał biologiczny – wyizolowane komórki, fragmenty tkanek zwierzęcych i ludzkich, tkanki roślinne, ekstrakty komórkowe. Mogą być to zarówno próbki świeżo izolowane, jak i mrożone lub utrwalone w parafinie. Stosując rozdział białek zdenaturowanych w pierwszym etapie próbki umieszcza się w roztworze PBS (lub innym neutralnym, fizjologicznym środowisku) z dodatkiem TritonX-100 (PBS + 0,01% Triton X). Jest to szeroko stosowany niejonowy surfaktant pozwalający na odzyskanie komponentów błonowych w łagodnych nie denaturujących warunkach. W celu ochrony białek przez działaniem proteaz można stosować dodatkowo inhibitory proteaz np. Complete (Roch), należy jednak sprawdzić, szczególnie w przypadku badania aktywnych enzymów lub receptorów, czy nie wpłyną one na przebieg reakcji i końcowy wynik.Objętość próbki w roztworze powinna wynosić maksymalnie 1 ml, średnio 300-500µl. Następnym krokiem jest rozbicie badanego materiału do mieszaniny białek, zazwyczaj przy użyciu ultradźwięków (sonifikacja). W celu denaturacji białek i zniszczenia ich struktury sonifikację wykonuje się na lodzie. Do tak przygotowanej próbki dodaje się bufor próbkowy (Sample Buffer np. NuPAGE® LDS Sample Buffer Invitrogen), w skład którego wchodzi barwik oraz glycerol. W warunkach denaturujących konieczne jest zastosowanie czynnika redukującego. Może być to dodany do buforu próbkowego β-merkaptoetanol (BME), DTT lub gotowy NuPAGE® Sample Reducing Agent (Invitorgen), niezależnie od użytego odczynnika, próbkę w skład której wchodzi materiał badany, bufor próbkowy, reduktor i woda, poddaje się denaturacji termicznej w 75°C (5-10 min). BME jest stosowany w celu redukcji białkowych wiązań dwusiarczkowych przed elektroforezą w żelach poliakrylamidowych, zazwyczaj w stężeniu nie przekraczającym 5%. Rozszczepienie miedzycząsteczkowych wiązań dwusiarczkowych (pomiędzy podjednostkami) pozwala podjednostkom białka na niezależny rozdział w buforze. Rozszczepienie wewnątrzczastczkowych wiązań dwusiarczkowych (wewnątrz podjednostek) pozwala na całkowitą denaturację podjednostek, tak by każdy peptyd mógł migrować w żelu zgodnie z długością łańcucha, a nie strukturą drugorzędową. BME znajduje również zastosowanie w spowalnianiu reakcji utleniania składników biologicznych w roztworach. Drugi z ze zwiazków, DTT, pozwala na utrzymanie w stanie zredukowanym grup SH i tym samym redukcje dwusiarczków, a dodany do buforu próbkowego redukuje wiązania dwusiarczkowe białek. Można go również stosować do redukcji mostków dwusiarczkowych bocznych N,N`bis(akryloil)cystaminy w żelach poliakrylamidowych. DTT jest mniej toksyczny niż BME i można go stosować w mniejszych ilościach, zazwyczaj 7-krotnie niższym stężeniu (100mM) niż BME (5% v/v, 700mM). Wadą jest wysoka cena – 1075 zł za 5g, w porównaniu do 274zł za 250ml BME (Sigma).


2. Rozdział białek w żelach poliakrylamidowych.

Obecnie na rynku dostępnych jest szereg gotowych do użycia żeli poliakrylamidowych. Są to zarówno klasyczne żele SDS-PAGE z dodatkiem SDS (dodecylosiarczan sodowy), jak i żele o przedłużonej (nawet do roku czasu) przydatności do użycia. Elektroforeza w obecności SDS pozwala na rozdział białek odpowiednio do ich masy cząsteczkowej, co odpowiada długości łańcucha polipeptydowego. SDS denaturuje białka, rozbija wiązania niekowalencyjne, co powoduje dysocjację poszczególnych podjednostek, eliminuje to efekt rozdziału pod względem kształtu. Średnio 1,5 grama SDS jest w stanie związać się z 1 gramem białka. Rozdział białek wykonuje się w żelach poliakrylamidowych, wykorzystując tzw. elektroforezę nieciągła, która umożliwia maksymalny rozdział. Oznacza to, że żel składa się z dwóch warstw (żel zatężający/wyrównujący i rozdzielający różnią procentowoscią) a również bufor doelektroforezy (running buffer) ma nieco odmienny skład w górnym i w dolnym zbiorniku aparatu do elektroforezy. Próbki nakładane na żel mogą mieć różną objętość, w zależności od wielkości studzienki, ponieważ w czasie przechodzenia przez górną warstwę żelu zostają zagęszczone do wąskiego pasma aby w dolnym żelu ulec rozdzieleniu na pojedyncze prążki. W metodzie półilościowej objętość próbki jest wprost proporcjonalna do stężenia białka (średnio 30-50µg) i zazwyczaj różna. W metodzie ilościowej objętość próbek nanoszonych na żel jest jednakowa. Dzięki temu , że rozdział zachodzi w zależności od długości łańcucha polipeptydowego można ustalić masę cząsteczkową danego białka przez porównywanie ze standardami o znanych masach, z dokładnością do 5-10%. Rozdział przeprowadza się w obecności buforów do elektroforezy (Running Buffer), zazwyczaj przy stałym napięciu 200V. Całkowity rozdział uzyskuje się zazwyczaj po około 1 godz. Kasetę z żelem umieszcza się w komorze do elektroforezy wypełnioną Running Buffer, większą płytką ku sobie, tak by przy nanoszeniu do studzienek końcówka pipety opierała się o wystający kawałek szybki/plastiku. W komercyjnych, gotowych żelach poliakrylamidowych na większej części widnieje zazwyczaj opis żelu i obramowanie poszczególnych studzienek, co ułatwia nanoszenie próbek. Następnie mocuje się elektrodę . Jednocześnie można przeprowadzać elektroforezę jednego/dwóch lub kilku żeli, w zależności od tego jak dużą komorą do elektroforezy dysponujemy. Do buforu znajdującego się w części z elektrodą (pomiędzy żelami) można dodać antyoksydant, który stabilizuje dodatkowo rozdział. Do jednej ze studzienek nanosi się również znacznik mas (może być połączony przeciwciałami znakowanymi np. HRP).


3. Transfer białek z żelu na membranę nitrocelulozową/PVDF/nylonową

Po zakończeniu elektroforezy białka z żelu są przenoszone, również w polu elektrycznym, na specjalne membrany. Transfer można wykonywać na dwa sposoby – „na sucho” wykorzystując dwie płaskie elektrody pomiędzy którymi umieszcza się żel i membranę (bez buforu do transferu) lub „na mokro” w takim samym układzie, ale z buforem do transferu. W skład buforu do transferu (Transfer Buffer) wchodzą: gotowy Transfer Buffer (stężony), woda dejonizowana i metanol. Bufor taki można również wykonać samemu:

• Tris base (12 mM) 1,45 g
• Glycine (96 mM) 7,2 g
• Methanol (20% stężenie końcowe) 200 ml lub 100 ml (10% stężenie końcowe)
• Woda dejonizowana, dopełnić do 1 litra

Przeprowadzając transfer “na mokro” należy około 10 min przed końcem elektroforezy należy w buforze do transferu namoczyć gąbki (blotting pads), którymi wykłada się kasetę z elektrodami do transferu białek. Namoczyć należy również Filter Paper, rodzaj bibuły ułatwiający przepływ prądu. Należy przygotować membrany oraz Filter Paper i dociąć je tak, by pasowały rozmiarem do żelu. Można również użyć gotowych „kanapek” składających się z już dociętych membran i papieru. W celu ułatwienia sobie pracy należy ołówkiem oznaczyć którą stroną membrana będzie przyłożona do żelu. Membrany PVDF należy na krótko namoczyć w metanolu, etanolu lub izopropanolu, następnie przemyć w wodzie dejonizowanej i umieścić w płaskim naczyniu w 50-100ml buforu do transferu (na kilka minut). Membrany nitrocelulozowe lub nylonowe należy umieścić na chwilę w buforze do transferu, bezpośrednio przed użyciem. Po zakończeniu elektroforezy, żel należy wyjąć z ograniczającej go kasety i ułożyć na Filter Paper, a na nim membranę i kolejny papier. Bardzo ważne jest by usunąć bąbelki powietrza pomiędzy membraną a żelem, które mogą utrudniać transfer. Bąbelki usuwa się ku krawędziom żelu przez rolowanie pipetą/szklaną bagietką papieru umieszczonego na membranie. Tak powstałą „kanapkę” z dwóch stron obkłada się namoczonymi wcześniej gąbkami i zamyka w kasecie do transferu. „Kanapka” i gąbki powinny być położone na katodzie (-), poziomo, około 1 cm od końca elektrod. (Ryc.1)

Transfer można przeprowadzać z jednego żelu na membranę lub jednocześnie z dwóch żeli na dwie membrany. Jeśli przeprowadzamy transfer z jednego żelu, natychmiast po elektroforezie należy wyjąć żel z kasety. Jeśli korzystamy z gotowych żeli (np. Invitrogen) żel jest umieszczony w plastikowej kasecie, którą otwiera się przy pomocy specjalnego noża dołączonego do zestawu do transferu. Podczas otwierania kasety, strona ze studzienkami powinna być skierowana ku górze. Można usunąć pozostałe u góry żelu studzienki. Na żel należy nałożyć namoczony wcześniej filter paper i usunąć bąbelki powietrza. Następnie pozostałą część kasety trzeba odwrócić i położyć (papierem do dołu) na dłoni w rękawiczce lub na powierzchni pokrytej Parafilmem. Usuwanie żelu z plastikowej powierzchni kasety można wykonać na dwa sposoby:

• Jeśli żel pozostał na dłuższej płytce (z okienkiem na dole w komercyjnych gotowych żelach) należy wypchnąć go poprzez podłużny otwór na dole kasety, używając dołączonego noża
• Jeśli żel pozostał na krótszej płytce (ze studzienkami) należy lekko podważyć dół żelu, obrócić ku dołowi i pozwolić by powoli przesunął się na powierzchnię papieru

Po przeniesieniu na papier obcina się dół żelu, zwilża powierzchnię buforem do transferu i nanosi namoczoną wcześniej mambranę, tak by nie pozostawić bąbelków powietrza. Następnie umieścić wilgotny filter paper i usunąć powstałe bąbelki. Umieścić 2 lub 3 namoczone gąbki w części z katodą, następnie żel z membraną i kolejne 2-3 (lub więcej) gąbek, tak by wystawały 0,5 cm powyżej katody. Żel pozostaję tym samym zawsze bliżej płytki z katodą. Umieścić anodę (+) na gąbkach (ryc. 2). Umieszczenie membrany pod żelem powoduje, że białka przenoszą się ma filter paper, zamiast na membranę.

Żel i membrana powinny ściśle przylegać do siebie podczas transferu, by zapewnić ich kontakt na całej powierzchni. Ponieważ gąbki po wielu użyciach tracą swoją sprężystość do zapewnienia odpowiedniego dopasowania obu elektrod do siebie należy używać większej ilości gąbek. Powinno się je wymienić gdy stają się przebarwione lub całkowicie tracą sprężystość. Obie części modułu do transferu należy mocno ścisnąć ze sobą, umieścić w komorze do transferu i zalać buforem do transferu z 10% zawartością metanolu (może być z dodatkiem antyoksydantu), tak by zakrył „kanapkę”, ale nie dosięgał końca elektrod. Powoduje to dodatkowe przewodzenie i wytwarzanie ciepła. Pozostałą część komory wypełnia się dejonizowaną wodą, do około 2 cm od brzegu komory, w celu odprowadzenia ciepła. Transfer przeprowadza się przy stałym napięciu 30V, przez 1 godzinę.

Chcąc przeprowadzić jednoczesny transfer dwóch żeli należy użyć buforu z 20% zawartością metanolu. Postępowanie z żelem po elektroforezie, namaczanie poszczególnych składowych „kanapki” pozostają takie same, jedyna różnica to ułożenie jej pomiędzy elektrodami. Należy umieścić 2 namoczone gąbki, na nich filter paper, żel, membranę i filter paper, gąbkę i jeszcze raz te same komponenty. (Ryc. 3)

Optymalizacja transferu i osiągnięcie wysokiej wydajności z żelu na membranę dotyczy szeregu parametrów, a celem jest ilościowy transfer wszystkich białek z żelu na membranę. Po transferze w żelu nie powinny pozostać żadne białka, lub tylko te o bardzo małej masie cząsteczkowej. Można to monitorować poprzez wybarwienie żelu po transferze. Jeśli transfer jest nieefektywny i większość białek pozostaje w żelu należy poprawić któryś z parametrów. SDS i alkohol są używane w większości protokołów, maja jednak przeciwstawny wpływ na wydajność transferu i dlatego konieczne jest dostosowanie zawartości obu do właściwości białek. SDS jest niezbędny do przemieszczania się białek i szczególnie użyteczny przy transferze dużych białek z żelu. Jednak wiązanie do membrany zachodzi dzięki interakcją hydrofobowym, więc zbyt duże stężenie SDS uniemożliwia wiązanie, szczególnie do nitrocelulozy. Wiązanie jest najwydajniejsze przy 0,01% dodatku SDS do buforu do transferu. Alkohol (metanol) jest używany w celu wzmocnienia hydrofobowego wiązania białek do membrany. Dodatek 10-20% metanolu wystarcza do poprawienia wiązania białek do nitrocelulozy. Kolejnym ważnym parametrem jest procentowość żelu poliakrylamidowego. Niższa procentowość ułatwia transfer na membranę, więc należy wybierać te o najniższej procentowości, ale dostosowane do masy cząsteczkowej białka. Żele gradientowe (np. 4-12%) są idealne do rozdziału białek o różnej wielkości, ponieważ porowatość żelu jest dopasowana do różnego rozmiaru białek. Dla efektywnego transferu ważna jest też grubość żelu. Białka łatwiej ulegają przeniesieniu z cienkich żeli, dlatego należy wybierać te o grubości od 1mm do 1,5 mm, jeśli pozwala na to objętość próbki, której objętość nie może przekraczać 30 l. Równie istotne jest napięcie podczas transferu. Jeśli jest zbyt małe, a czas transferu za krótki część białek pozostanie w żelu. Przy zbyt wysokim, mniejsze białka mogą przechodzić przez membranę, zamiast się z nią związać. Jeśli białka pozostają w żelu należy zwiększyć napięcie o maksymalnie 5 V. Przy nadmiarze SDS wydłużanie czasu transferu i zwiększanie napięci nie są jednak pomocne. Po związaniu z membraną większość białek pozostaje na membranie, nawet podczas przedłużenie transferu. Ważny jest również typ używanej membrany. Wiązanie z nitrocelulozą zachodzi głównie poprzez wiązania hydrofobowe, dlatego też znajduje ona najszersze zastosowanie. Należy pamiętać, że mniejsze białka wymagają nitrocelulozy o mniejszej średnicy porów. PVDF wykazuje właściwości bardziej hydrofobowe niż nitroceluloza, wiąże silniej białka a wiązanie nie jest tak podatne na zwiększoną zawartość SDS. Membrany PVDF wymagają silniejszych warunków blokujących niż nitroceluloza, są odpowiednie do sekwencjonowania białek. Membrany nylonowe wiążą białka zarówno poprzez oddziaływania hydrofobowe, jak i elektrostatyczne. Wiązanie białek jest jeszcze bardziej odporne na SDS ni ż w przypadku PVDF, ale wymaga też jeszcze silniejszych warunków blokujących. Sugeruje się ich wykorzystanie w metodzie Northern i Southern blot.


4. Detekcja białek

Po zakończeniu transferu białek konieczne jest zablokowanie miejsc niespecyficznych na membranie, z którymi nie są związane białka. Do tego celu stosuje się bufor blokujący: 5% roztwór odtłuszczonego mleka w TPBS (PBS+0,1% Tween 20) lub TTBS (TBS + 0,1% Tween 20). Blokowanie przeprowadza się w temperaturze +4°C, na kołysce laboratoryjnej, przez noc lub 1 godzinę. Po zakończeniu inkubacji usuwa się bufor blokujący i przemywa membranę (1-2 krotnie) ok. 15 ml TPBS lub TTBS. Następnym etapem jest inkubacja membrany z pierwszorzędowymi przeciwciałami (monoklonalnymi lub poliklonalnymi), skierowanymi swoiście przeciwko poszukiwanemu białku. Przeciwciała te są zazwyczaj niewyznakowane enzymem i wymagają zastosowania przeciwciał drugorzędowych (wyznakowanych) skierowanych przeciwko nim samym. Dostępne są również przeciwciała pierwszorzędowe wyznakowane, które po dodaniu substratu dają barwny produkt (prążek), co świadczy o obecności poszukiwanego białka. Zaletą takich przeciwciał jest szybsze uzyskanie wyniku, wadą wysoka cena, spowodowana koniecznością znakowania konkretnych, swoistych przeciwciał. Dlatego też znajdują one zastosowanie głównie w diagnostyce.

Pierwszorzędowe przeciwciała rozpuszcza się zazwyczaj w TPBS lub TTBS, z dodatkiem 5% odtłuszczonego mleka, lub bez mleka. Przeciwciała te to zazwyczaj frakcja IgG, dlatego też mleko (które może zawierać IgG) może interferować z wiązaniem białek. Pierwszorzędowe przeciwciała są gatunkowo-specyficzne, a producentami są: mysz, szczur, chomik, osioł, królik, owca, wiśnia, bydło, kot, pies, koza, świnka morska, koń, małpa. Przy pomocy kurcząt i indyków otrzymuje się frakcję przeciwciał klasy IgY. Inkubację z pierwszym przeciwciałem prowadzi się przez godzinę lub przez noc, w temperaturze pokojowej, na kołysce laboratoryjnej. Bardzo ważne jest rozcieńczenie przeciwciał, zgodnie z wytycznymi producenta, zazwyczaj mieści się ono w zakresie od 1:100 do 1:1000. Należy przygotować taką objętość roztworu przeciwciał, by pokrywała ona całą powierzchnię membrany, około 10ml. Jako pierwszorzędowe przeciwciała może również służyć surowica pobrana od ludzi. Po inkubacji należy przepłukać membranę trzykrotnie, po 5 min w TPBS lub TTBS, na kołysce. Ma to na celu usunięcie nadmiaru niezwiązanych przeciwciał. Kolejnym etapem jest inkubacja z drugorzędowymi przeciwciałami, skierowanymi swoiście przeciwko przeciwciałom pierwszorzędowym. Można stosować również przeciwciała skierowane swoiście przeciwko danym izotopom przeciwciał pierwszorzędowych np. przeciwko IgM, IgA, podklasom IgG., Przeciwciała drugorzędowe muszą pochodzić od innego gatunku niż pierwszorzędowe. Drugorzędowe przeciwciała są pozyskiwane od kóz, myszy, królików, osłów, bydła i są sprzężone z barwnikami fluorescencyjnymi, cząstkami złota lub enzymami. Najczęściej stosuje się peroksydazę chrzanową (HRP) lub alkaliczną fosfatazę (AP). Enzym zmienia kolor dodanego substratu: AP, w zależności od użytego substratu tworzony związek ciemnoniebieski lub purpurowy, HRP utlenienia substrat do ciemnego strątu w miejscu reakcji. Można wykryć za ich pomocą nawet 10-9 do 10-12 gramów białka. Do detekcji można również stosować awidynę lub streptawidynę, połączoną z enzymem (HRP lub AP). Oba te związki mają silne powinowactwo do biotyny, trwale się z nią wiążąc. Stosując ten system używa się pierwszorzędowych przeciwciał sprzężonych z biotyną i nie stosuje się przeciwciał drugorzędowych. Zamiast nich dodaje się awidynę lub streptawidynę połączoną z enzymem, pojedyncza cząstka związana jest z kilkoma cząsteczkami enzymu, dlatego metoda jest bardziej czuła. Stosowanie takiego układu zwiększa jednak koszty. W celu ograniczenia niespecyficznych reakcji przeciwciał drugorzędowych stosuje się również przeciwciała pierwszorzędowe są wyznakowane NIP (nitrojodofenol) i drugorzędowe skierowane przeciwko NIP, sprzężone z enzymem. Można stosować także przeciwciała wyznakowane radioaktywnie (125I) lub koloidalnym złotem, gdzie uzyskuje się bezpośrednie uwidocznienie reakcji, a stosując izotopy detekcja wymaga autoradiografii. Przeciwciała drugorzędowe stosuje się zazwyczaj w rozcieńczeniu 1:1000 – 1:20000 lub zgodnie z wytycznymi producenta. Należy przygotować taką objętość roztworu przeciwciał, by pokrywała ona całą powierzchnię membrany, około 20ml. Inkubacja powinna być prowadzona przez 1 godz, w temperaturze pokojowej, na kołysce laboratoryjnej. Po upływie tego czasu należy starannie odpłukać nadmiar przeciwciał, w przeciwnym razie otrzymamy ciemne tło, które może utrudnić odczyt wyników. Płukanie 3-5 krotne, po 5 minut, w TPBS lub TTBS. Najpowszechniej wykorzystywane są przeciwciała drugorzędowe połączone z HRP. Aby odczytać wynik reakcji wykorzystuje się zjawisko chemiluminescencji. W skład zestawów typu ECL, Chemiluminescence Luminol Reagent lub innego wchodzi luminol, który pod wpływem działania HRP emituje światło. Roztwór luminolu, przygotowanym według zaleceń producenta, zazwyczaj z dwóch składowych, nanosi się na membranę, w objętości około 6-8 ml i inkubuje na wytrząsarce lub kołysce, w temperaturze pokojowej, bez dostępu światła przez 5 min. Następnie membranę należy lekko osuszyć z nadmiaru odczynnika, przez dotknięcie kantem do papierowego ręcznika. Tak przygotowaną membranę należy zamknąć w folii, zgrzać jej krawędzie i odczytać wynik. Odczytu reakcji można dokonać na dwa sposoby, stosując urządzenie do odczytu chemiluminescencji lub za pomocą kliszy fotograficznej. W pierwszym przypadku otrzymujemy obraz w postaci cyfrowej, który można poddać obróbce graficznej. Czas zbierania przez urządzenie emitowanego światła nie powinien przekraczać 3-5 min. W drugim przypadku, klisza ulega naświetleniu przez luminol i otrzymujemy obraz w skali 1:1, który można poddać obróbce graficznej po uprzednim zeskanowaniu negatywu. Zaletą tego rozwiązania jest możliwość przyłożenia kliszy do nitrocelulozy ze standardem mas i sprawdzenia czy otrzymany prążek jest na odpowiedniej wysokości. W praktyce najlepiej łączyć obie techniki ze sobą. Luminol zachowuje właściwość emisji światła przez około 30 min do 1 godz, dlatego też po odczytaniu wyniku przez urządzenie, można na membranę (w ciemności) nałożyć kliszę fotograficzną. Jeśli rozdzielony materiał będzie potrzebny do dalszych analiz, a nie ma możliwości pobrania go ponownie membrany przechowuje się w temp. -80°C, aby następnie poddać je procesowi usunięcia przyłączonych przeciwciał i ponownej detekcji innych białek.