Justyna Bazan¹

¹Akademia Medyczna we Wrocławiu, Katedra  i Zakład Biochemii Lekarskiej, 50-368 Wrocław, ul.Chałubińskiego 10

Historia odkrycia bakteriofagów, czyli wirusów infekujących komórki bakteryjne, jest zaskakująca. Mimo, iż już w czasach starożytnych wykorzystywano niezwykłe właściwości niektórych wód w leczeniu chorób bakteryjnych np. trądu, to dopiero w 1896 roku Ernest Hanbury Hankin, brytyjski bakteriolog pracujący w Indiach opublikował, poprzez Instytut Pasteura, pracę pt. "L'action bactericide des eaux de la Jumna et du Gange sur le vibrion du cholera", w której to wykazał istnienie czynników antybakteryjnych w wodach Gangesu i Jumny. Hankin sugerował, że czynniki te, mogące przechodzić przez bardzo drobny filtr porcelanowy,  są odpowiedzialne za hamowanie rozwoju cholery. Praca ta nie została jednak doceniona. Blisko 20 lat później bakteriofagi zostały odkryte niezależnie przez dwóch badaczy: Fredericka Williama Twort i Félixa Huberta d’Hérelle. F.W. Twort, brytyjski patolog pracujący w Instytucie Browna w Londynie podczas badań nad transformacją bakteryjną odkrył obecność czynnika, który może rozprzestrzeniać się i zakażać szczep Micrococcus. Zaproponował on kilka hipotez wyjaśniających ten fenomen. Najbardziej trafną z nich było stwierdzenie, że czynnik ten ma charakter wirusa. W tym samym okresie Félix H. d’Hérelle, Kanadyjczyk pracujący w Instytucie Pasteura w Paryżu, zaobserwował lizę kultury bakteryjnej Shigella [1, 2]. Zjawisko to opisał w roku 1917, stwierdzając odkrycie antagonisty laseczki czerwonki, mikroorganizmu o charakterze wirusa. F.H. d’Hérelle jako pierwszy zaproponował też używanie nazwy bakteriofag jako połączenia słowa bacteria z greckim słowem phagein (jeść). On też opisał pierwszy przypadek udanego leczenia czerwonki z użyciem bakteriofagów oraz opracował kilka metod używanych do dziś. Charakter wirusowy bakteriofagów został definitywnie określony w 1940 roku, po wynalezieniu mikroskopu elektronowego [1].

W drugiej połowie XX w. bakteriofagi stały się najważniejszym modelem stosowanym w biologii molekularnej. Dzięki nim dokonano wielu kluczowych odkryć m.in. ukazano, że DNA jest materiałem genetycznym, odkryto obecność oraz rolę mRNA w ekspresji genów. Jednakże po wprowadzeniu pod koniec ubiegłego stulecia systemów pozwalających badać złożone procesy zachodzące w komórkach eukariotycznych, wielu badaczy zaprzestało badań nad bakteriofagami. Pozostała jednak pewna grupa naukowców, której dalsze badania nad tymi wirusami zaowocowały wieloma odkryciami, dzięki którym w ostatnich latach na nowo zaczęto interesować się fagami [3].

Klasyfikacja bakteriofagów

Bakteriofagi stanowią bardzo liczną i zróżnicowaną grupę. Pierwszy system taksonomiczny do klasyfikacji fagów wprowadził F.H. d’Hérelle. Uważał on, że istnieje tylko jeden gatunek bakteriofagów Bacteriophagum intestinale, w którym zawiera się wiele szczepów. Holmes sklasyfikował fagi ze względu na gospodarza. Wyróżnił on podrząd, pojedynczą rodzinę i pojedynczy rodzaj rzęduVirales. Jednak podział wirusów na wirusy zwierzęce, roślinne i bakteryjne nie był wystarczający. Lwoff, Horne i Tournier utworzyli system klasyfikacji wirusów oparty na morfologii i typie kwasu nukleinowego. Zaproponowali oni rząd Urovirales dla bakteriofagów ogonkowych oraz rodzinę Microviridae dla fagów typu ΦX. Chociaż dwie ostatnie charakterystyki są używane do określania rodzin, nie ma uniwersalnych kryteriów określania rodzaju i gatunku dla fagów [1, 2].

The International Committee for Taxonomy of Viruses (ICTV) w swoim pierwszym raporcie sklasyfikował fagi w 6 podstawowych rodzajach, jednak od tego czasu poznano wiele nowych grup fagów. Do 1995 roku ICTV uporządkowało ponad 4000 wirusów roślinnych i zwierzęcych w 71 rodzin, 11 podrodzin i 164 rodzaje. Natomiast do roku 2000 około 5300 wirusów bakteryjnych zostało przebadanych dzięki mikroskopii elektronowej [1, 2].

Obecnie ICTV klasyfikuje bakteriofagi jako jeden rząd, 13 rodzin i 30 rodzajów. Klasyfikacja ta jest oparta na charakterystyce morfologicznej, biochemicznej i serologicznej oraz na strukturze genomu i analizie sekwencyjnej [1, 2]. Istotny jest również typ gospodarza i choroba jaką wywołuje wirus. ICTV bazuje na systemie klasyfikacji Baltimore, który został opracowany przez laureata nagrody Nobla Davida Baltimore’a i wprowadza podział wirusów na 7 grup [4]:

Grupa I: wirusy z podwójna nicią DNA (Herpesviridae, Poxviridae, Adenoviridae i Papovaviridae)

Grupa II: wirusy z pojedynczą nicią DNA o dodatniej polarności (+) DNA lub wymagające obecności wirusa pomocniczego do namnożenia (Circoviridae  i Parvoviridae)

Grupa III: wirusy z podwójną nicią RNA (Reoviridae i Birnaviridae)

Grupa IV: wirusy RNA z pojedynczą nicią o dodatniej polarności (Astroviridae, Caliciviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Picornaviridae, Arteriviridae i Togaviridae)

Grupa V: wirusy RNA z pojedynczą nicią o ujemnej polarności RNA (Arenaviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Bunyaviridae i Rhabdoviridae)

 Grupa VI: wirusy RNA pojedynczą nicią i odwrotną transkryptazą (Retroviridae)

Grupa VII: wirusy DNA z odwrotnie transkrybowaną kolistą podwójną nicią (Hepadnaviridae)

Wiriony fagów mogą być ogonkowe, wielościenne, filamentowe lub pleomorficzne. Fagi ogonkowe stanowią najliczniejszą grupę zawierającą 4950 znanych bakteriofagów. Zostały one sklasyfikowane jako rządCaudovirales zawierający trzy duże powiązane filogenetycznie rodziny. Pozostałe fagi stanowiące zaledwie 190 poznanych gatunków zostały podzielone na 10 mniejszych rodzin. Większość fagów wielościennych, filamentowych i pleomorficznych posiada łacińskie nazwy, natomiast fagi ogonkowe posiadają jedynie swoiste nazwy (np. fag typu T4) [2].

Klasyfikacja bakteriofagów nie jest stała, jej ciągłe zmiany spowodowane są odkrywaniem i wprowadzaniem coraz to nowszych narzędzi biologii molekularnej.

Morfologia

Chociaż bakteriofagi mają podobną do wirusów eukariotycznych morfologię i skład, posiadają one kilka dość unikatowych cech. Jedną z nich jest obecność kapsydu złożonego z białek zorganizowanych w kapsomery.  W większości bakteriofagów kapsyd otaczający kwas nukleinowy składa się wyłącznie z jednego rodzaju białka, a kompleks białkowo-nukleinowy coraz częściej określany jest mianem nukleokapsydu. Bakteriofagi mogą zawierać niemalże wszystkie możliwe rodzaje kwasów nukleinowych. W tej grupie, poza najczęściej występującym w przyrodzie jednoniciowym RNA oraz dwuniciowym DNA, możemy spotkać dwuniciowe RNA oraz jednoniciowe DNA, a nawet unikalne także wśród bakteriofagów segmentowane dwuniciowe RNA.

Niektóre bakteriofagi posiadają materiał genetyczny w formie kolistej, ale także są przedstawiciele posiadający liniowe lub helikalne formy kwasów nukleinowych [2, 5].

Wiriony fagowe mają bardzo zróżnicowane formy. Większość fagów posiada ogonki przyłączone do główki, która może mieć różne kształty. Główki fagów mogą być wielościenne, cylindryczne, sferyczne, o kształcie wrzeciona itd. Jednak w większości przypadków są to ikosaedry lub sześciany (w przypadku fagów ogonkowych). Także ogonki fagów wykazują dużą różnorodność. Mogą one różnić się długością, kurczliwością, występowaniem osłonki. Ogonek bakteriofaga w przeważającej większości przypadków zawiera płytkę podstawową, wypustki i włókna ułatwiające adhezję do bakterii. Niektóre bakteriofagi posiadają również otoczki, przy czym mogą one być białkowe, białkowo-lipidowe lub lipidowe. Obecność lipidów w otoczce powoduje wysoką wrażliwość na chloroform i eter [1, 2, 5].

Bakteriofagi wykazują również znaczne różnice w wielkości cząstki. Średnica większości cząstek bakteriofagów mieści się w granicach 30-60 nm. Jednak w niektórych systemach wodnych można spotkać głównie fagi o średnicy mniejszej niż 30 nm, w innych zaś dominują te o średnicy ponad 60 nm. Istnieją także „gigantyczne bakteriofagi” o średnicy od 200 do >700 nm, a największy jak dotąd poznany bakteriofag ma ponad 750 nm średnicy [6].

Charakterystyka bakteriofagów

Bakteriofagi pojawiły się wcześniej niż organizmy eukariotyczne i stanowią najstarszą z poznanych grup wirusów. Bakteriofagi występują wszędzie tam gdzie znaleźć można bakterie. Ich zdolność przetrwania aż do dziś sugeruje, że posiadają one większe zdolności zmiany genotypu i fenotypu niż jakiekolwiek inne organizmy. Bakteriofagi nie tylko koewoluowały wraz z bakteriami, dostosowując się do gospodarza, ale również stały się najliczniejszą i najbardziej zróżnicowaną grupą wirusów. Każdego roku liczba bakteriofagów wzrasta o ok. 100 nowo poznanych przedstawicieli tej grupy [2, 7].

Ilość wirusów na świecie szacuje się na 10³¹ z czego znaczną większość stanowią wirusy bakteryjne [8]. Bakteriofagi najliczniej występują w środowiskach wodnych, zarówno w wodach słodkich jak i słonych, gdzie ich stężenie wynosi od 10⁴ do 10⁸ cząstek na ml. W świeżej wodzie ich ilość może wynosić od 0,65 do 3*10⁹/g i aż do 12*10⁹/g w systemach morskich. W glebach bakteriofagi występują mniej licznie, choć ich ilość szacuje się na 0,7 do 2,7*10⁸/g [9].

Bakteriofagi cechuje również duża różnorodność. Szacuje się, że w 200 litrach wody morskiej występuje ok 5000 różnych genotypów wirusowych i aż 1 mln genotypów w 1 kg osadu morskiego. Ostatnie badania nad wirusami prokariotycznymi sugerują znaczne zróżnicowanie genotypów w obrębie lokalnym, jednak relatywnie niskie w stosunku do puli genomów na świecie [8].

Także ilość wirusów przypadających na 1 bakterię zmienia się w zależności od miejsca występowania. W glebie współczynnik ten może wynosić nawet 100 cząstek wirusów na 1 bakterię, jednak w niekorzystnych warunkach (nieodpowiednia temperatura czy pH) liczba ta może spaść do 1 wirusa na 100 bakterii [6].

Bakteriofagi stały się interesującym materiałem do badań nie tylko w biologii – ze względów poznawczych, ale przede wszystkim mają ogromne znaczenie w medycynie i biotechnologii.

Wirusy te mogą być skutecznie stosowane w bardzo specyficznym leczeniu infekcji bakteryjnych, stanowiąc swoistą alternatywę dla antybiotyków. Dzięki nowoczesnym metodom badawczym odkryto, że wiele toksyn produkowanych przez patogenne bakterie jest kodowanych w genomach fagowych.

Niektóre bakteriofagi stanowią ogromny problem w procesach biotechnologicznych,  inne zaś okazują się pomocne w unikaniu i usuwaniu zakażeń mogących wystąpić w tych procesach [3].

Wiele zagadnień dotyczących bakteriofagów nie zostało jeszcze wyjaśnionych, a współczesne badania ukazują coraz to szersze możliwości aplikacyjne dla tych wirusów.

 [1] Ackermann, H. W., Bacteriophage observations and evolution, Research in Microbiology 2003, 154, 245-251

[2] Gregoracci, G. B., et al., The biology of bacteriopfages, w G. Węgrzyn (red.), Modern bacteriophage biology and biotechnology. Research Signpost, Trivandrum, India, 2006

[3] Węgrzyn, G., (red.), Modern bacteriophage biology and biotechnology, Research Signpost, Trivandrum, India, 2006.

[4] Encyklopedia nation master www.nationmaster.com/encyclopedia/Virus-classification (01.03.2011)

[5] Ackermann, H.W., Encyclopedia of Microbiology, Vol I, J.S. Lederberg (red), Academic Press, Burlington, USA, 2000

[6] Weinbauer M. G. Ecology of prokaryotic viruses. FEMS Microbiol Rev., 2004, 28, 127-181

[7] Ackermann, H. W., Phages examinated in electron microscope. Brief review, Arch Virol, 2007, 152, 227-243

[8] Breitbart, M., Rohwer, F., Here a virus, there a virus, everywhere the same virus?, Trends Microbiol, 2005, 13(6), 278-284

[9] Górski, A., Weber-Dąbrowska, B., The potential role of endogenous bacteriophages in controlling invading pathogens, CMLS, Cell. Mol. Life Sci., 2005, 62, 511-519 

Tabela 1. Ogólna klasyfikacja bakteriofagów, na podstawie źródła [1]

(ds – dwuniciowy, ss – jednoniciowy, L– liniowy, C– kolisty, T– superhelikalny, S–segmentowany)