Wstęp

Przeciwciała, inaczej zwane immunoglobinami (Ig), należą do jednych z najważniejszych narzędzi nowoczesnej medycyny, które warunkowały i nadal warunkują jej szybki rozwój. Zastosowania przeciwciał obejmują szeroki zakres aspektów diagnostyki laboratoryjnej oraz terapii chorób infekcyjnych, nowotworowych, czy autoimmunologicznych. Wykorzystywane są również w transplantologii i leczeniu antykoagulacyjnym. Spektrum zastosowań poszerza się wraz z rozwojem biotechnologii i technik biologii molekularnej, które pozwalają na projektowanie, do celów klinicznych, immunoglobulin o określonych właściwościach. Niniejszy artykuł stanowi zwięzłe zestawienie terapeutycznych zastosowań, inżynierii genetycznej oraz sposobów projektowania przeciwciał dla potrzeb medycyny.

I. Ogólna charakterystyka przeciwciał

1) Budowa i klasy przeciwciał.
Przeciwciała są ciężkimi białkami globularnymi o masie około 150 kDa. Występują w surowicy krwi oraz innych płynach zewnątrzkomórkowych gospodarza, stanowiąc jeden z podstawowych efektorów odpowiedzi immunologicznej. Produkowane są przez wyspecjalizowane limfocyty B, czyli komórki plazmatyczne nazywane również komórkami wytwarzającymi przeciwciała (AFC – ang. antibody-forming cells). Podstawowa struktura przeciwciała, immunoglobuliny G, przedstawiona jest na rysunku 1. IgG jest zbudowana z czterech polipeptydów: dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (H, ~55kDa) oraz dwóch identycznych łańcuchów lekkich (L, ~25kDa) połączonych mostkami dwusiarczkowymi oraz wiązaniami niekowalencyjnymi (Rys. 1). Różnice w budowie łańcuchów ciężkich determinują funkcje oraz przynależność przeciwciał do jednej z pięciu klas (Tab. 1): IgA (łańcuch alfa), IgD (delta), IgE (epsilon), IgG (gamma), IgM (mi). Łańcuchy lekkie mogą występować w dwóch wariantach: kappa oraz lambda [1-3]. Oba typy spotykane są we wszystkich klasach przeciwciał [4], nie ma między nimi różnic funkcjonalnych, zwiększają różnorodność immunoglobin [1].


Tabela 1 – Klasy immunoglobulin i ich funkcje.




W łańcuchach lekkich i ciężkich przeciwciał wyróżniamy części zmienne (V), zlokalizowane w odcinku N-terminalnym oraz części stałe (C), obejmujące odcinek C-terminalny. Regiony zmienne łańcuchów ciężkich oraz lekkich tworzą miejsce wiązania antygenu (antigen-binding domain), w których możemy wyróżnić 3 regiony hiperprzemienne, nazywane regionami determinującymi dopasowanie (CDR – ang. complementarity determining regions) oraz 4 regiony zrębowe (FR – ang. frame regions). To właśnie różnice w sekwencji aminokwasów (i związane z tym różnice w konformacji przestrzennej) regionów CDR determinują swoistość przeciwciał [2,3]. Fragment przeciwciała wiążący antygen nazywamy paratopem, natomiast fragment antygenu, który łączy się z przeciwciałem nazywamy determinanta antygenową lub epitopem [3]. Antygen może posiadać wiele różnych epitopów reagujących ze swoistymi przeciwciałami.

Łańcuchy ciężkie w immunoglobulinie połączone są mostkami dwusiraczkowymi w tzw. regionie zawiasowym (H – ang. hinge). Jest on podatny na trawienie enzymami takimi jak papaina lub pepsyna. W wyniku fragmentacji cząsteczki Ig papainą, która przecina przeciwciało powyżej mostka dwusiarczkowego, otrzymujemy dwa identyczne fragmenty Fab (zawierające miejsca wiążące antygen) oraz fragment Fc. W następstwie proteolizy pepsyną, przecinającą cząsteczkę Ig poniżej mostka dwusiarczkowego, powstaje fragment F(ab’)2, zawierający 2 miejsca wiązania antygenu oraz fragment pFc’ [2].


Rysunek 1 – Immunoglobulina. CDR – regiony determinujące dopasowanie, CH – części stałe łańcuchów ciężkich, CL – część stała łańcucha lekkiego, VH – część zmienna łańcucha ciężkiego, VL – część zmienna łańcucha lekkiego, FR – regiony zrębowe.


2) Efektorowe funkcje przeciwciał

Przeciwciała posiadają zdolność do wiązania się z określonym antygenem obecnym na powierzchni pewnych komórek organizmu (np. nowotworowych, zakażonych wirusem) lub bakterii. Powstanie kompleksu antygen-przeciwciało powoduje wystąpienie różnych efektów biologicznych, prowadzących do neutralizacji czynnika chorobotwórczego przez [5]:
- aktywację dopełniacza
- indukcję fagocytozy (funkcja zależna od fragmentu Fc przeciwciała)
- indukcję cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC – ang. antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; funkcja zależna od fragmentu Fc przeciwciała)
- bezpośrednią neutralizację (np. blokowanie działania toksyn)
Immunoglobuliny bezpośrednio nie uszkadzają i nie niszczą antygenu, dlatego wymagane jest zaangażowanie innych cząsteczek i komórek układu immunologicznego, które posiadają na swojej powierzchni receptory dla fragmentu Fc. To właśnie fragment Fc przeciwciała pełni kluczową rolę w procesach fagocytozy i zewnątrzkomórkowego zabijania (ADCC) przez makrofagi, eozynofile i komórki K [5].

3) Przeciwciała mono i poliklonalne

Większość antygenów posiada złożoną strukturę, w której można wyróżnić wiele różnych epitopów rozpoznawanych przez dużą liczbę limfocytów B. W wyniku aktywacji antygenem, limfocyty przekształcają się w komórki plazmatyczne produkujące Ig przeciwko różnym epitopom danego antygenu. Takie przeciwciała określa się mianem poliklonalnych (PAbs – ang. polyclonal antibodies). W przeciwieństwie do nich, przeciwciała monoklonalne (MAbs – ang. monoclonal antibodies) są produkowane przez klon limfocytów B, wywodzący się od pojedynczego limfocytu. Takie przeciwciała rozpoznają tylko jeden konkretny epitop danego antygenu (Rys. 2).
Które przeciwciała są lepsze? Mono, czy poliklonalne? W przypadku konieczności detekcji wielu różnych epitopów, kiedy istotna jest amplifikacja sygnału, na przykład w testach takich jak ELISA, Western blotting, immunochistochemia czy cytometria przepływowa, lub też w przypadku silnie konserwowanych białek o niskiej immunogenności, lepszym wyborem może okazać się surowica poliklonalna [6]. Zaletą przeciwciał monoklonalnych jest ich monospecyficzność, użyteczna m.in. podczas badania zmian konformacyjnych cząsteczek, oddziaływań między białkami, stanów fosforylacyjnych lub wykrywania poszczególnych białek w obrębie danej rodziny [2]. Chociaż produkcja MAbs jest skomplikowana i czasochłonna (patrz rozdz. II) to uzyskane stabilnych linii komórkowych produkujących przeciwciała o określonej specyficzności stanowi nieograniczone źródło Ig o wysokim mianie i czystości [2,6], co jest wielkim atutem w zastosowaniach przemysłowych. Surowice poliklonalne, otrzymywane w tradycyjny sposób z wykorzystaniem zwierząt (rozdz. II), są bardzo niejednorodne. Zawierają przeciwciała różniące się przynależnością do klas, a także swoistością i powinowactwem [7].

Rysunek 2 – Różnice pomiędzy przeciwciałami poli oraz monoklonalnymi.


II. Otrzymywanie oraz inżynieria genetyczna przeciwciał

1) Otrzymywanie przeciwciał poliklonalnych.

Tradycyjną metodą produkcji surowic poliklonalnych jest immunizacja zwierząt określonym antygenem, a następnie (po uzyskaniu odpowiedniego miana Ig) pobranie krwi i otrzymanie surowicy. Do tego celu najczęściej wykorzystywane są kury, kozy, świnie, owce, króliki, myszy, szczury i chomiki. Dobór zwierząt do produkcji przeciwciał powinien uwzględniać:

1) potrzebną ilość immunoglobulin
2) dystans filogenetyczny pomiędzy dawcą antygenu, a zwierzęciem mającym wytwarzać przeciwciała (im większy dystans tym większa szansa na uzyskanie wysokiego miana przeciwciał)
3) charakterystykę otrzymanych przeciwciał (klasy, podklasy, możliwość wiązania dopełniacza)

Chociaż do produkcji PAbs najczęściej wykorzystuje się króliki, wielu badaczy preferuje kury ze względu na dystans filogenetyczny dzielący ich od ssaków. Kury wytwarzają duże ilości przeciwciał IgG, które mogą być pozyskiwane ze składanych przez nie jajek, co pozwala na uniknięcie procedury skrwawiania zwierząt. Niestety zakres zastosować kurzych immunoglobulin jest ograniczony m.in. ze względu brak wiązania składnika C1 układu dopełniacza ssaków [8].
Immunizacja danym antygenem powinna uwzględniać jego: rozmiar, stopień agregacji oraz stan (natywny lub zdenaturowany). Polipeptydy o masie cząsteczkowej < 10 kDa oraz antygeny niebiałkowe powinny być sprzęgane z większymi, immunogennymi białkami takimi jak KLH (ang. - keyhole limpet hemocyanin) lub albumina bydlęca (BSA – ang. bovine serum albumin) [8].
Bardzo istotnym czynnikiem, który należy uwzględnić podczas produkcji przeciwciał jest konformacja przestrzenna antygenu. Chcąc otrzymać immunoglobuliny specyficzne względem natywnej formy białka, do immunizacji również należy wykorzystać białko w jego natywnym stanie. Jeśli uzyskane Ig mają zostać wykorzystane np. w metodach opartych na blottingu, w których białka ulegają denaturacji, to zwierzę również powinno być immunizowane antygenem w stanie zdenaturowanym [8].
Celem wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej względem podanego antygenu stosuje się nieswoiste modulatory tzw. adiuwanty. Adiuwanty spowalniają uwalnianie antygenu z miejsca podania, indukują powstanie miejscowej reakcji zapalnej, ułatwiają prezentację antygenu w kontekście MHC klasy II, aktywują dopełniacz i komórki układu immunologicznego (limfocyty T i B, makrofagi) [9]. Adiuwanty nie mogą powodować zmiany składu chemicznego antygenu [10], wykazywać właściwości antygenowych i stymulować swoistej reakcji immunologicznej [9].


Do produkcji przeciwciał najczęściej wykorzystuje się następujące adiuwanty:

• Kompletny Adiuwant Freunda (CFA – ang. complete Freund’s adjuvant) – jest emulsją typu woda w oleju, składa się z parafiny lub oleju naturalnego (zazwyczaj Bayol F) i wody. Jako środek emulgujący wykorzystywana jest lanolina lub Arlacel A. CFA dodatkowo zawiera zabite prątki gruźlicy (Mycobacterium tuberculosis) lub składniki ich ściany komórkowej [10]. CFA silnie stymuluje odpowiedź komórkową i humoralną oraz utrzymuje antygen w miejscu podania nawet do 6 miesięcy. Z uwagi na wysoką toksyczność stosowany jest wyłącznie u zwierząt, przeważnie podczas pierwszego podania antygenu wykazującego słabe właściwości do indukowania odpowiedzi immunologicznej [11].

• Niekompletny Adiuwant Freunda (IFA – ang. incomplete Freund’s adjuvant) – posiada taki sam skład jak CFA, nie zawiera jednak zabitych prątków lub ich komponentów. Zwiększa odpowiedź humoralną, zmniejsza wymagana ilość antygenu, przedłuża do 1 miesiąca fazę czynnej syntezy immunoglobulin. Stosowany podczas kolejnych iniekcji antygenu [9].

• Ribi Adjuvant System (RAS) – jest emulsją typu olej w wodzie, zawiera ulegający przemianom metabolicznym olej (skwalen) oraz Tween80 jako środek emulgujący. W skład RAS wchodzą również przetworzone komponenty mykobakterii oraz bakteryjny lipid A. RAS jest mniej toksyczny od CFA lecz zarazem mniej skuteczny [11].

• Titermax – należy do nowej generacji adiuwantów o wysokiej efektywności (porównywalnej do CFA) i niskiej toksyczności. W jego skład wchodzi opatentowany, niejonowy blokowy kopolimer CLR-8941, cząsteczki silikonowe opłaszczone CLR-8941, skwalen oraz Tween 80. Powierzchnia kopolimeru CLR-8941 umożliwia upakowanie dużej ilości antygenu, znacznie większej niż w przypadku wolnego antygenu w roztworze. Dodatkowo CLR-8941 powoduje aktywację układu dopełniacza, komórek układu immunologicznego oraz zwiększa ekspresję MHC klasy II na powierzchni makrofagów [11].

Nie ma potrzeby użycia adiuwantów jeśli do immunizacji są wykorzystywane całe bakterie, komórki lub inne cząsteczkowe antygeny (frakcje komórkowe, ściany komórkowe bakterii) [12].
Po osiągnięciu odpowiedniego miana przeciwciał od immunizowanych zwierząt pobierana jest krew (nie więcej niż 15% całkowitej objętości), z której uzyskuje się surowicę zawierającą przeciwciała poliklonalne (Rys. 3).



Rysunek 3 – Otrzymywanie przeciwciał poliklonalnych.

2) Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych.


Pierwszy etap produkcji przeciwciał monoklonalnych (dobór antygenu, adiuwantu, immunizacja) przebiega dokładnie tak samo jak w przypadku otrzymywania PAbs. W kolejnym etapie, po osiągnięciu odpowiedniego miana specyficznych przeciwciał w surowicy, pobiera się od immunizowanych zwierząt (przeważnie myszy) śledzionę, z której izoluje się pobudzone antygenem limfocyty B [13] (Rys. 4). Następnie uczulone limfocyty są hybrydyzowane w procesie fuzji z komórkami szpiczaka (nowotwór limfocytów B). Komórki szpiczaka nadają hybrydzie nieśmiertelność, umożliwiając tym samym dowolnie długą hodowlę in vitro, natomiast uczulone lim. B warunkują produkcję specyficznych przeciwciał [5].

Fuzję limf. B z komórkami szpiczaka przeprowadzą się w obecności substancji, które ułatwiają zlepianie błon komórkowych (lizolecytyna, glikol polietylenowy). Jednak nie wszystkie komórki ulęgają fuzji. Fuzja może też dotyczyć dwóch takich samych komórek (dwie komórki szpiczaka lub dwa limfocyty) [7]. Aby wyeliminować komórki, które nie uległy fuzji lub połączyły się z taka samą komórką, stosuje się specjalne, selektywne podłoże zawierające hipoksantynę, aminopterynę oraz tymidynę (HAT – ang. hypoxanthine-aminopterin-thymidine), które umożliwia przeżycie wyłącznie hybrydom [13]. Mechanizm działania podłoża HAT polega na specyficznym blokowaniu reduktazy dihydrofolianowej (ang. - dihydrofolate reductase) przez aminopterynę, co uniemożliwia syntezę DNA „de novo” i podział komórek. Nukleotydy niezbędne do syntezy DNA mogą być jednak syntetyzowane z wykorzystaniem alternatywnej drogi przy udziale kinazy tymidynowej oraz fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej (HGPRT – ang. hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase), dla których substratami są odpowiednio tymidyna i hipoksantyna zawarte w podłożu.
Około tydzień przed rozpoczęciem fuzji, komórki szpiczaka inkubuje się w podłożu z dodatkiem 8-azaguaniny (analog hipoksantyny), co umożliwia przeżycie komórkom szpiczaka, które nie posiadają aktywnej HGPRT (8-azaguanina wbudowana do DNA powoduje śmierć komórek). Komórki szpiczaka (HGPRT- ), które nie uległy fuzji z limfocytami zginą w podłożu HAT, ponieważ nie będą w stanie produkować nukleotydów potrzebnych do syntezy DNA (brak HGPRT oraz blokada reduktazy dihydrofolianowej przez aminopterynę). Limfocyty B, które nie uległy fuzji zginą w podłożu z uwagi na krótki czas życia.

W kolejnym etapie hybrydomy są rozdzielane na specjalnych płytkach hodowlanych w taki sposób, aby w jednym dołku znajdowała się pojedyncza komórka. Klon komórek powstałych z namnożenia się pojedynczej komórki będzie wytwarzał przeciwciała specyficzne względem konkretnego epitopu danego antygenu. Każdy klon komórek sprawdza się pod kątem możliwości produkcji przeciwciał, ich specyficzności oraz zdolności do ciągłego wzrostu hybryd. Zazwyczaj na 100 mln. limfocytów uzyskuje się zaledwie kilka przeciwciał monoklonalnych [5]. Wyselekcjonowane klony komórek produkujących immunoglobuliny mogą być hodowane in vitro na skalę przemysłową. Szacunkowo około 90% MAbs można produkować w ten sposób. Zdarzają się jednak sytuacje kiedy uzyskane hybrydomy nie są w stanie przystosować się do warunków in vitro lub immunoglobuliny nie spełniają pokładanych w nich oczekiwań (np. różnice w glikozylacji Ig otrzymywanych in vitro i in vivo, i związane z tym różnice w specyficzności). W takim wypadku klony komórek wstrzykuje się do otrzewnej u myszy, co powoduje powstanie wodobrzusza (łac. ascites). Płyn gromadzący się w otrzewnej zawiera duże ilości przeciwciał monoklonalnych [13]. Metoda produkcji przeciwciał monoklonalnych in vivo powinna być prowadzona tylko w uzasadnionych przypadkach z uwagi na cierpienie zwierząt.



Rysunek 4 – Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych.


3) Inżynieria genetyczna przeciwciał - projektowanie przeciwciał do celów terapeutycznych

Modułowa budowa przeciwciał stwarza duże możliwości ingerencji w ich strukturę, pozwalając na projektowanie cząsteczek o określonych właściwościach. Inżyniera molekularna umożliwia poprawienie właściwości farmakokinetycznych, immunogenności, specyficzności oraz funkcji efektorowych immunoglobulin.

a) Przeciwciała chimeryczne i humanizowane

Zastosowanie mysich przeciwciał monoklonalnych w leczeniu chorób u ludzi wiąże się z pewnymi ograniczeniami i problemami. Nawet jeśli mysie Ig wykazują wysoką specyficzność względem antygenu, to nie zawsze są w stanie aktywować ludzki dopełniacz oraz komórki posiadające receptory dla fragmentu Fc. Jeśli jednak mysie Ig wykazują efektywność in vivo, to układ immunologiczny człowieka szybko wytwarza immunoglobuliny skierowane przeciwko mysim Ig (HAMA – ang. human anti-mouse antibody) i w ten sposób je neutralizuje [14]. Badania kliniczne z wykorzystaniem silnie immunogennych mysich MAbs nie wykazały, aby wytworzenie HAMA wiązało się z zagrażającymi życiu efektami ubocznymi, jednak ich obecność obniżała skuteczność terapii [15,16]. Co ciekawe, w niektórych przypadkach zaobserwowano, że HAMA mogą przedłużać życie pacjentów z guzami litymi. Wiąże się to z tym, że ludzkie Ig skierowane przeciwko mysim immunoglobulinom (przeciwciała antyidiotypowe) fizycznie przypominają antygeny nowotworowe. Wytworzone przez organizm przeciwciała anty-antyidiotopowe mogą w ten sposób wiązać antygeny nowotworowe [15].
Celem zmniejszenia immunogenności Ig i zminimalizowania ryzyka wytworzenia specyficznych, neutralizujących przeciwciał (HAGA – ang. human anti-globulin antibody), immunoglobuliny poddaje się procesowi humanizacji. Humanizacja polega na zastąpieniu poszczególnych regionów mysich przeciwciał ich ludzkim odpowiednikiem, przy użyciu technik rekombinacji DNA. W zależności od tego jak duża część Ig uległa modyfikacji, wyróżniamy przeciwciała chimeryczne (chMAb) oraz humanizowane (huMAb).

W przeciwciałach chimerycznych ludzkim wariantem zastępowane są regiony stałe łańcuchów ciężkich (CH1, CH2, CH3) oraz lekkich (CL) (Rys. 5). W przypadku huMAbs wszystkie fragmenty Ig ulęgają humanizacji z wyjątkiem regionów determinujących dopasowanie (CDR). Proces humanizacji przeciwciał wiąże się jednak z ryzykiem utraty specyficzności, dlatego aby otrzymać wysoce swoiste huMAbs pozostawia się jeden lub więcej mysich wariantów regionów zrębowych (FR) [17].


Rysunek 5 – Schematyczny rysunek przedstawiający proces humanizacji przeciwciał.

Czynione są również próby otrzymywania w pełni ludzkich MAbs. Jest to utrudnione z powodu braku odpowiednich ludzkich linii szpiczakowych oraz ze względów etycznych (ludzi nie immunizuje się celem otrzymania uczulonych limfocytów B) [7]. Jedną z alternatywnych metod jest wykorzystanie techniki prezentacji białek regionu wiążącego antygen na powierzchni bakteriofagów (ang. – phage display). Część zmienna łańcucha lekkiego Ig jest kodowana przez dwa geny: V (ang. – variable) oraz J (joining). Repertuar genów V, kodujących region wiążący antygen, jest pobierany z populacji limfocytów lub tworzony in vitro. Następnie geny V są łączone z genami kodującymi białka powierzchniowe bakteriofaga. Tak skonstruowanymi bakteriofagami zakaża się komórki bakteryjne w wyniku czego na powierzchni nowo powstałych wirusów prezentowane są białka kodowane przez region V. Kolekcja rekombinowanych bakteriofagów, z których każdy prezentuje na swojej powierzchni inny wariant regionu wiążącego antygen jest nazywana biblioteką fagową (ang. – phage libary). Wykorzystując chromatografię powinowactwa, z biblioteki selekcjonuje się wirusy, których białka prezentowane na powierzchni będą najsilniej wiązać się z danym antygenem. Tak wybranymi bakteriofagami zakaża się nowe komórki bakteryjne i ponownie selekcjonuje wirusy. Czynność powtarza się do momentu wyselekcjonowania wirusów o największym powinowactwie względem antygenu. Geny kodujące miejsce wiązania antygenu, które są unikalne dla każdego bakteriofaga, mogą być następnie odzyskane i użyte do skonstruowania całych przeciwciał [18].
Inna metoda produkcji ludzkich MAbs wykorzystuje myszy transgeniczne, u których mysie geny kodujące immunoglobuliny zostały zastąpione ludzkimi. Tak zmodyfikowane zwierzęta produkują ludzkie MAbs po immunizacji antygenem [14].
Kolejną techniką wytwarzania MAbs jest immunizacja myszy cierpiących na ciężki złożony niedobór odporności (SCID – ang. severe combined immunodeficiency), których układ immunologiczny rekonstruuje się poprzez podanie limfocytów z krwi obwodowej człowieka. Uczulone limfocyty B są następnie izolowane i łączone z komórkami szpiczaka [14].


b) Poprawa właściwości farmakokinetycznych

Wymagania dotyczące farmakokinetyki przeciwciał zależą od ich późniejszych zastosowań. Na przykład, długi okres półtrwania w surowicy jest pożądany jeśli Ig ma indukować cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC – ang. antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) lub cytotoksyczność zależną od dopełniacza (CDC – ang. complement-dependent cytotoxicity). Krótki okres półtrwania powinien charakteryzować Ig służące jako nośniki dla radioizotopów, leków cytotoksycznych lub toksyn. Cząsteczki przeciwciał o masie > 60 kDa (masa IgG wynosi około 150 kDa) znajdują się powyżej progu nerkowego i nie mogą przejść przez ściany naczyń włosowatych kłębuszków nerkowych, co skutkuje wydłużonym okresem półtrwania w surowicy [19].
Opracowano wiele metod mających na celu zmniejszenie masy Ig i poprawienie właściwości farmakokinetycznych przy jednoczesnym zachowaniu zdolności do wiązania się z antygenem. Jednym z przykładów jest pojedynczy łańcuch Fv (scFv – ang. single chain variable fragment) składający się wyłącznie z regionów VH oraz VL immunoglobuliny połączonych krótkim białkiem. Dzięki zredukowanej masie (około 30 kDa) okres półtrwania scFv w surowicy wynosi < 10 min., co czyni go szczególnie przydatnym w zastosowaniach diagnostycznych, ale jednocześnie ogranicza możliwości terapeutyczne. Łańcuchy scFv można łączyć, również z innymi fragmentami takimi jak region Fc, tworząc cząsteczki multiwalentne o określonych właściwościach farmakokinetycznych (Rys. 6) [19].


Rysunek 6 – Różne formy przeciwciał o zmodyfikowanych właściwościach farmakokinetycznych, uzyskane przy pomocy technik inżynierii genetycznej. MW – masa cząsteczkowa, t1/2 w surowicy – okres półtrwania w surowicy.

c) Przeciwciała o podwójnej swoistości.

Naturalnie występujące Ig są monospecyficzne tzn. mogą wiązać się tylko z jednym antygenem. Postęp jaki dokonał się w inżynierii przeciwciał umożliwił powstanie Ig o podwójnej swoistości (bsAb – ang. bispecific antibody). Jeden fragment bsAb może być skierowany przeciwko antygenowi obecnemu na powierzchni komórki nowotworowej, a drugi będzie wiązał cytotoksyczny limfocyt T, toksynę lub inną biologicznie czynną cząsteczkę. Najprostszym wariantem jest chemiczne połączenie dwóch różnych MAbs, z których każdy będzie wiązał inny antygen.

BsAbs można otrzymać w wyniku fuzji dwóch hybryd produkujących MAbs, takie Ig są również nazywane kwadroma [7,19] (Rys. 7). Inną klasą rekombinowanych Ig są diciała (ang. – diabodies), składające się z dwóch połączonych białkiem łańcuchów VH oraz VL [19,20].

Jednym z ciekawszych rozwiązań w projektowaniu wielospecyficznych fragmentów Ig jest zastosowanie tzw. domen dimeryzacji i dokowania (DDD – ang. dimerization and docking domain) oraz domen kotwiczących (AD – ang. anchoring domain). Fragmenty przeciwciał o określonej specyficzności mogą być tworzone oddzielnie tak, aby posiadały albo DDD, albo AD. W zależności od potrzeb, zmieszanie fragmentów przeciwciał posiadających DDD powoduje ich dimeryzację, następnie fragment posiadający domenę AD zespala tak powstałą cząsteczkę [19] (Rys. 7).


Rysunek 7 – Różne formy przeciwciał o podwójnej swoistości.

d) Zwiększenie funkcji efektorowych przeciwciał.

Wiele MAbs stosowanych w celach terapeutycznych zabija docelowe komórki w wyniku ADCC oraz CDC, w których kluczową rolę odgrywa fragment Fc przeciwciała. W przypadku ADCC, region Fc immunoglobuliny związanej do powierzchni np. komórki nowotworowej, oddziałuje z receptorami dla fragmentu Fc (FcR) znajdującymi się na powierzchni różnych komórek efektorowych takich jak neutrofile, makrofagi oraz komórki NK. Komórki nowotworowe mogą także zostać zniszczone w wyniku aktywacji dopełniacza (CDC, droga klasyczna), kiedy składnik C1q wiąże się do regionu Fc przeciwciała związanego z antygenem [17,19].
Wzrost powinowactwa fragmentu Fc względem FcR, a tym samym zwiększenie zdolności do indukcji ADCC, można osiągnąć modyfikując profil glikozylacji fragmentu Fc. Udowodniono m.in., że brak fukozy w N-glikanach wzmaga zdolność IgG1 do wiązania się z FcgammaRIII, co powoduje 50 krotne zwiększenie ADCC [19].
Przeciwciała z poprawioną zdolnością do aktywacji układu dopełniacza zostały opracowane dzięki mapowaniu miejsc odpowiedzialnych za wiązanie składnika C1q przez fragment Fc IgG i wprowadzenie miejscowo-specyficznych mutacji w genach kodujących fragment Fc [17].

e) Łączenie przeciwciał z aktywnymi biologicznie cząsteczkami.,

Jednym z najlepiej przebadanych sposobów zwiększania efektywności terapeutycznej jest łączenie MAbs z różnymi aktywnymi biologicznie cząsteczkami takimi jak toksyny, cytokiny, leki przeciwnowotworowe, radioizotopy, czy enzymy aktywujące leki.
Przeciwciała sprzęga się z takimi immunotoksynami jak rycyna, abryna, saporyna, dyfterotoksyna,alfa-sarcyna i inne. Immunotoksyny wykazują bardzo wysoką aktywność, do zabicia komórki nowotworowej wystarczy tylko jedna cząsteczka rycyny lub dyfterotoksyny. Tak wysoka toksyczność oraz fakt, że istnieje niewiele całkowicie swoistych antygenów nowotworowych, a tym samym przeciwciała wiążą się również ze zdrowymi komórkami [7], spowodował zakończenie wielu prowadzonych badań klinicznych [17]. Celem zmniejszenia działań niepożądanych opracowano szereg strategii takich jak miejscowo specyficzna pegylacja (łączenie z glikolem polietylenowym) rekombinowanych immunotoksyn [17], blokowanie glikopeptydami czy łączenie tylko wybranych łańcuchów toksyn z immunoglobulinami [7].
Cytokiny takie jak interleukina 2 (IL-2), interferon gamma (INFgamma), czynnik martwicy nowotworów (TNF) są wykorzystywane w immunoterapii nowotworów, jednak ich stosowanie wiąże się w wysoką toksycznością i szeregiem działań niepożądanych. Łączenie cytokin z MAbs wydłuża okres ich półtrwania w surowicy, obniża toksyczność systemową oraz pozwala na ograniczenie działania immunomodulujacego do miejsc zmienionych chorobowo [19].
Kolejną metodą jest łączenie Ig z enzymami, które przekształcają proleki w aktywne leki przeciwnowotworowe (ADEPT – ang. antibody-directed enzyme prodrug therapy). Dzięki lokalnemu działaniu, w miejscu gromadzenia się przeciwciał, istnieje możliwość zmniejszenia toksyczności terapii [7].
Radioimmunoterapia (RIT – ang. radioimmunotherapy) wykorzystuje do leczenia nowotworów przeciwciała sprzęgnięte z radioizotopami emitującymi cząstki takimi jak jod 131, itr 90, ren 186 i 188 [17]. Atutem RIT w leczeniu guzów litych jest zdolność do zabijania komórek znacznie oddalonych od miejsca, w którym doszło do związania Ig [7]. Wspomniany efekt może jednak prowadzić do uszkodzenia zdrowych tkanek otaczających nowotwór (szczególnie tkanki krwiotwórczej) powodując ciężką toksyczność [17].


III. Zastosowania przeciwciał do celów terapeutycznych.

Pierwsze kliniczne zastosowania przeciwciał datuje się na koniec XIX, kiedy Emil Behring oraz Shibasabura Kitasato z Instytutu Higieny Roberta Kocha w Berlinie pokazali, że surowica zwierzęcia immunizowanego dyfterotoksyną może zostać wykorzystana do zneutralizowania śmiertelnych dawek tej samej toksyny u innego zwierzęcia. Pasywna immunizacja ludzi surowicą końską zawierającą immunoglobuliny skierowane przeciwko dyfterotoksynie pozwoliła obniżyć w Paryżu śmiertelność na skutek błonicy z 52 do 25%. Niestety częstym powikłaniem terapii była zagrażająca życiu choroba posurowicza [21]. Inne problemy, związane z otrzymywaniem przeciwciał poliklonalnych, takie jak konieczność wykorzystywania zwierząt i duża niejednorodność poszczególnych partii surowicy, zostały opisane w rozdziale II. Dopiero opracowanie metody produkcji wysoce jednorodnych przeciwciał monoklonalnych oraz inżyniera genetyczna spowodowały lawinowy rozwój terapii opartych na immunoglobulinach.
Pierwszym MAb do zastosowań klinicznych był zatwierdzony przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA – ang. Food and Drug Administration) w 1986, Orthoclone OKT3, lek stosowany w zapobieganiu odrzucenia przeszczepów po transplantacjach. Od tego czasu ponad 20 różnych MAbs zostało zatwierdzonych do leczenia nowotworów, chorób autoimmunologicznych, infekcyjnych, zakrzepicy, czy zapobiegania odrzucaniu przeszczepów. Dziesiątki innych MAbs znajdują się w fazie badań klinicznych [22]. Poniższa tabela stanowi zestawienie MAbs zatwierdzonych przez FDA.



Tabela 2 – Przeciwciała monoklonalne zatwierdzone przez FDA do wykorzystania w lecznictwie.