„Konwencjonalne leki zawierają substancje czynne o podobnych często parametrach fizyko-chemicznych. Są to na ogół niewielkie związki, o masie cząsteczkowej niższej niż 500 Daltonów (Da), niepolarne, hydrofobowe, których działanie polega na wiązaniu białek docelowych i blokowaniu (modyfikacji) ich funkcji (tabela1). Poszukiwanie kolejnych związków czynnych polega na wykorzystywaniu dotychczasowych doświadczeń w tej dziedzinie i na dokładnej analizie szlaków metabolicznych wraz z ich wzajemnymi powiązaniami. Takie podejście pozwala na dość precyzyjne prognozowanie co do skuteczności analizowanego specyfiku w warunkach in vivo. Niestety, duży odsetek potencjalnych leków zostaje odrzucany w kolejnych etapach- na poziomie badań w fazie przedklinicznej oraz klinicznej [Corey 2007].
Niezależnym środkiem leczniczym w terapii wielu chorób mogłoby być zahamowanie ekspresji białek poprzez ingerencje w obrębie ich sekwencji kodujących, co jest teoretycznie możliwe dzięki odkrytym mechanizmom. Działanie tych naturalnie występujących zjawisk opiera się na obecności niewielkich cząsteczek kwasów nukleinowych o charakterystycznej zazwyczaj budowie, które mogłyby stanowić skuteczny środek terapeutyczny. W zależności od mechanizmu działania, można wyróżnić kilka możliwych strategii wyciszenia ekspresji genów.”
- Możliwe strategie wyciszania genów.
- Szczególne cechy kwasów nukleinowych wpływające na ich zastosowanie jako leki.
- Leki oparte na bazie kwasów nukleinowych.
Śląski Uniwersytet Medyczny, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej,
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej
Grzegorz Machnik
Leki na bazie kwasów nukleinowych.
Adres do korespondencji:
ul. Narcyzów 1, 41-200 Sosnowiec,
Konwencjonalne leki zawierają substancje czynne o podobnych często parametrach fizyko-chemicznych. Są to na ogół niewielkie związki, o masie cząsteczkowej niższej niż 500 Daltonów (Da), niepolarne, hydrofobowe, których działanie polega na wiązaniu białek docelowych i blokowaniu (modyfikacji) ich funkcji (tabela1). Poszukiwanie kolejnych związków czynnych polega na wykorzystywaniu dotychczasowych doświadczeń w tej dziedzinie i na dokładnej analizie szlaków metabolicznych wraz z ich wzajemnymi powiązaniami. Takie podejście pozwala na dość precyzyjne prognozowanie co do skuteczności analizowanego specyfiku w warunkach in vivo. Niestety, duży odsetek potencjalnych leków zostaje odrzucany w kolejnych etapach- na poziomie badań w fazie przedklinicznej oraz klinicznej [Corey 2007].
Tabela 1. Porównanie cech fizyko-chemicznych konwencjonalnych związków czynnych z kwasami nukleinowymi o własnościach terapeutycznych (na przykładzie siRNA)
|
|
Leki konwencjonalne |
Kwas rybonukleinowy (siRNA) |
|
Masa cząsteczkowa
|
ok. 500-700Da
|
każda z nici RNA: ok. 7000Da
|
|
Forma aktywna:
|
pojedyncza cząsteczka
|
dwuniciowy siRNA
|
|
Cechy biochemiczne:
|
<5 donorów wodoru, >10 akceptorów wodoru |
cząsteczka silnie zjonizowana
|
|
Rozpuszczalność:
|
słabo rozpuszczalne w wodzie lub hydrofobowe |
dobrze rozpuszczalne w wodzie
|
|
Zdolność do przechodzenia przez błony komórkowe: |
bardzo łatwo przechodzi przez błony |
utrudniony transport przez błony
|
|
Liczba cząsteczek docelowych:
|
ograniczona (trudna identyfikacja cząsteczek wiążących niektóre białka) |
teoretycznie nieograniczona (regulacja ekspresji na poziomie genu) |
|
Opracowanie leku
|
żmudna optymalizacja działania leku |
szybka optymalizacja działania leku |
|
|
|
|
Opracowano na podstawie Corey D.R., 2007
Niezależnym środkiem leczniczym w terapii wielu chorób mogłoby być zahamowanie ekspresji białek poprzez ingerencje w obrębie ich sekwencji kodujących, co jest teoretycznie możliwe dzięki odkrytym mechanizmom. Działanie tych naturalnie występujących zjawisk opiera się na obecności niewielkich cząsteczek kwasów nukleinowych o charakterystycznej zazwyczaj budowie, które mogłyby stanowić skuteczny środek terapeutyczny. W zależności od mechanizmu działania, można wyróżnić kilka możliwych strategii wyciszenia ekspresji genów.
Możliwe strategie wyciszania genów:
Strategia interferencji RNA (RNAi).
Mechanizm interferencji RNA (RNAi) stanowi występujący m.in. u roślin odpowiednik układu immunologicznego ssaków i jest skutecznym sposobem na ograniczenie inwazji różnorodnych wirusów [Ding S-W i wsp., 2004; Mourrain P. i wsp., 2000]. Zjawisko RNAi u ssaków również występuje w sposób naturalny, jednak nie spełnia roli ochrony przeciwwiusowej, jak to ma miejsce w przypadku roślin i niższych organizmów, lecz chroni organizm przed nadmierną ekspresją endogennych sekwencji o charakterze retrotranspozonów [Svoboda P. i wsp., 2004]. W interferencji RNA inhibicja ekspresji genów następuje za pośrednictwem kompleksu białek z kwasem rybonukleinowym, zwanego RISCs (od angielskiego skrótu: RNA-Induced Silencing Complex). W pierwszym etapie dwuniciowe cząsteczki RNA (ang. double-stranded RNA, dsRNA), które pojawiają się w komórce, ulegają przecięciu przez enzym Dicer (RNAza klasy III). Cząsteczki dsRNA są natychmiast rozpoznawane przez komórki dzięki temu, że ta forma RNA nie występuje na ogół w przyrodzie, a jej pojawienie się wskazuje na obecność wirusa. Może też być wynikiem nadmiernej ekspresji tzw. „genetycznych pasożytów”, czyli retrotranspozonów lub podobnych do nich elementów. W efekcie hydrolizy enzymatycznej prowadzonej przez Dicer, z dwuniciowego RNA tworzone są krótkie, nadal dwuniciowe cząsteczki RNA o długości około 22 nukleotydów, posiadające na końcu 3’ dwa wolne nukleotydy, a na końcu 5’ grupę fosforanową. Są one nazywane krótkimi, interferencyjnymi RNA (siRNA). Krótkie, interferencyjne RNA wchodzą w skład kompleksu RISC i umożliwiają odnajdywanie (na zasadzie komplementarności łańcuchów kwasu nukleinowego) oraz wiązanie kompleksu za pomocą wiązań wodorowych do docelowych sekwencji mRNA. Aktywny kompleks RISC, dzięki wchodzącym w jego skład nukleazom, katalizuje następnie rozpad enzymatyczny odnalezionej sekwencji mRNA [Hannon G.J., 2002].
Strategia antysensownych oligonukleotydów (ASO).
Strategia oligonukleotydów antysensownych wykorzystuje fakt, że mRNA podlegający procesowi transkrypcji jest cząsteczką jednoniciową i pozostaje zdolną do tworzenia wiązań wodorowych z komplementarnym do niej innym fragmentem kwasu nukleinowego. Utworzony w ten sposób dupleks DNA/RNA znacznie utrudnia przebieg procesu transkrypcji i następującej po nim translacji, powodując w rezultacie spadek ekspresji danego genu. Dzięki tym obserwacjom dokonano stosunkowo prostych i skutecznych prób wyciszenia ekspresji różnych genów. Było to możliwe poprzez dostarczanie do komórek fragmentów jednoniciowego DNA komplementarnych do sekwencji badanego genu.
Antysensowne oligonukleotydy projektuje się w celu uzyskania konkretnego. Okazuje się jednak, że efekt końcowy, czyli zahamowanie ekspresji genu poprzez ASO ma charakter złożony i jest wypadkową co najmniej kilku typów oddziaływań. Stwierdzono, że tworzone dupleksy DNA/RNA mogą: 1.) blokować etap inicjacji i elongacji transkrypcji oraz przyłączanie czynników transkrypcyjnych [Cutrona G., 2000; Hanvey J., 1992]; 2.) inhibować powstawanie modyfikacji na końcach 5’ oraz 3’ mRNA- 7-metyloguanidyny i łańcucha poliA a także zaburzać proces splicingu mRNA; 3.) blokować odczyt informacji genetycznej przez rybosomy; 4.) indukować aktywność enzymatyczną RNA-zy H, której substratem są cząsteczki RNA wchodzące w skład dupleksów DNA/RNA oraz RNA/RNA.
Rybozymy są cząsteczkami RNA, które posiadają zdolności katalityczne. Zostały odkryte w początku lat 80-tych XX wieku i opisane w pracy Kruger i wsp [Kruger K. i wsp., 1982]. Rybozymy występują w komórkach, gdzie pełnią określone funkcje katalityczne, przy czym najczęściej mają one charakter autokatalityczny, tzn. prowadzą hydrolizę własnej cząsteczki. Późniejsze badania wykazały jednak, że rybozymy mogą również funkcjonować w układzie in trans, tj. katalizować hydrolizę innych cząsteczek RNA. Ta cecha została wykorzystana do stworzenia (selekcji) sztucznych rybozymów o aktywności skierowanej przeciwko mRNA wybranych genów. Tym samym możliwe jest zastosowanie rybozymów w terapii chorób człowieka. Odbywałoby się to poprzez prowadzenie hydrolizy cząsteczek mRNA kodujących niepożądany produkt białkowy, będący np. przyczyną stanu chorobowego. Spośród wszystkich znanych rybozymów największe znaczenie praktyczne mają rybozymy typu hammerhead (główki młotka) oraz hairpin (spinki do włosów).
Rybozymy hammerhead. Ten rodzaj rybozymów jest jak dotąd przedmiotem najintensywniejszych badań pod kątem zastosowania w terapii chorób. Rybozymy hammerhead zostały odkryte w niektórych satelitarnych RNA wirusów roślinnych oraz w wiroidach. i są najmniejszymi spośród naturalnie występujących rybozymów. W naturze posiadają zdolność do hydrolizy enzymatycznej liniowych konkatamerów, które są wynikiem replikacji kolistych cząsteczek RNA patogenów roślinnych. Szczególnie znaczące jest wyselekcjonowanie takich wariantów rybozymów, które są zdolne do katalizy reakcji w układzie in trans, ponieważ tylko takie cząsteczki mogą mieć potencjalne znaczenie praktyczne. Główną przeszkodą w zastosowaniu rybozymów hammerhead do celów terapeutycznych jest ich wysokie zapotrzebowanie na jony magnezu. Doświadczenia prowadzone w warunkach in vitro wykazały, że rybozymy hammerhead wykazują największą aktywność przy stężeniu jonów Mg2+ wynoszącym 10mM. Naturalnie w środowisku wewnątrzkomórkowym występuje dużo niższy, submilimolarny poziom Mg2+. Aby ominąć ten istotny problem, prowadzi się selekcję in vitro takich rybozymów, które wykazują wysoką aktywność w niskich stężeniach jonów magnezu w środowisku. Oprócz selekcji możliwe jest wprowadzenie modyfikacji struktury rybozymów. Odpowiednie zmiany w budowie rybozymu poza centrum aktywnym wpływają znacząco na aktywność enzymatyczną cząsteczki, np. umożliwiają prowadzenie reakcji przy niskich stężeniach Mg2+. W chwili obecnej rybozymy typu hammerhead o odpowiednio zmodyfikowanej budowie cząsteczki są analizowane w warunkach in vitro i in vivo w organizmach zwierząt laboratoryjnych. Badania te osiągnęły już fazę kliniczną.
Rybozymy hairpin. Ten typ domeny katalitycznej cząsteczek RNA, podobnie jak rybozymy hammerhead, został odkryty w RNA satelitarnym niektórych wirusów roślinnych. Tak jak inne małe rybozymy, hairpin katalizuje hydrolizę prekursorowych konkatamerów do formy dojrzałej. Konkatamery powstają poprzez replikację według modelu obracającego się koła (ang rolling circle replication) i muszą ulec dalszej obróbce enzymatycznej, która zachodzi właśnie dzięki rybozymom. W zależności od warunków reakcji, rybozymy hairpin mogą katalizować reakcje hydrolizy bądź ligacji cząsteczek RNA. Jak dotąd odkryto niewiele rybozymów typu hairpin. Najbardziej znanym jest rybozym pochodzący z wirusa satelitarnego mozaiki tytoniu (TMSV). Analizując budowę i aktywność tego rybozymu wykazano, że wielkość motywu katalitycznego hairpin wynosi około 50 nukleotydów. Motyw ten może zostać użyty do prowadzenia reakcji hydrolizy zależnej od stężenia jonów metali w układzie in trans. Składa się on z dwóch domen, każda z nich posiada z kolei dwa regiony helikalne oddzielone pętlą wewnętrzną. Rybozymy hairpin nie zawierają w swym centrum aktywnym ściśle przyłączonego jonu metalu. Aktywność katalityczna, jak się przypuszcza, zależy od ułożenia i dokładnej orientacji przestrzennej substratowego RNA. Jony metalu są prawdopodobnie niezbędne w rybozymach hairpin do przeprowadzenia etapu fałdowania cząsteczki i tworzenia struktury przestrzennej. Aktywność katalityczna rybozymu może być stymulowana przez sperminę (jedną z poliamin występujących w komórkach eukariotycznych). Rybozymy hairpin zostały wyselekcjonowane głównie w kierunku ich działania przeciwwirusowego. dwa z tego typu rybozymów mogą łączyć się z różnymi regionami RNA wirusa HIV-1 i wykazują inhibicję replikacji w warunkach in vitro. W tym celu u osób zarażonych wirusem HIV przeprowadzona została transdukcja limfocytów CD4+ za pomocą rybozymu anty-HIV. Uzyskiwano spadek replikacji wirusa po około 2-3 tygodniach. Dzięki tym obiecującym wynikom możliwe było przeprowadzenie I fazy badań klinicznych. Innym aspektem wykorzystania aktywności rybozymów hairpin jest ich zdolność do katalizy ligacji cząsteczek RNA. Może to umożliwić na przykład proces naprawy wadliwego RNA pacjenta.
Szczególne cechy kwasów nukleinowych wpływające na ich zastosowanie jako leki.
W odróżnieniu od konwencjonalnych substancji czynnych zawartych w lekach, kwasy nukleinowe są cząsteczkami o znacznie większej masie (każdy deoksynukleotyd posiada masę cząsteczkową ok. 333Da, natomiast rybonukleotyd- ok. 340Da), przy czym kwasy nukleinowe stosowane jako leki będą mieć długość co najmniej 20 nukleotydów. W związku z tym, każda z 21-nukleotydowych nici RNA w siRNA posiada masę cząsteczkową około 7000Da. Ponadto kwasy nukleinowe posiadają ujemny ładunek elektryczny, co jest spowodowane obecnością szkieletu z kwasu fosforowego. Oba te parametry znacznie utrudniają proces przedostawania się takich cząsteczek przez błony komórkowe do wnętrza komórek. Leki wykorzystujące aktywność kwasów nukleinowych mają docelowo wpływać na mechanizm wyciszania genów, a więc oddziaływać na mRNA na poziomie transkrypcji bezpośrednio po niej. W tym celu niezwykle ważne jest precyzyjne dobranie sekwencji wprowadzanego kwasu nukleinowego, którego działanie musi być bardzo specyficzne, Z jednej strony powinien on skutecznie hamować ekspresję genu odpowiedzialnego za wystąpienie schorzenia, a jednocześnie pozostać neutralnym w stosunku do wszystkich pozostałych genów pacjenta. Równolegle z poszukiwaniem jak najbardziej skutecznych sekwencji oligonukleotydów prowadzone są prace służące polepszeniu ich dystrybucji w obrębie tkanek i komórek. Na prowadzonym obecnie etapie badań, wprowadzenie egzogennego kwasu nukleinowego do wnętrza komórek w warunkach in vitro wymaga zastosowania dodatkowych związków chemicznych (np. liposomów) lub innych metod, np. elektroporacji lub odpowiednich wektorów. Okazało się jednak, że w przeciwieństwie do badań in vitro, dostarczenie kwasów nukleinowych do określonych tkanek i komórek u zwierząt doświadczalnych jest stosunkowo proste i skuteczne, przynajmniej w zakresie wymaganym dla wykazania funkcji terapeutycznej. Na przykładzie oligonukleotydów antysensownych (ASO), udowodniono, że szczególnie łatwo można dostarczyć te cząsteczki do komórek wątroby i do komórek tkanki tłuszczowej, ze względu na wysokie powinowactwo DNA/RNA do tych organów [Corey 2007]. W licznych badaniach prowadzonych na zwierzętach oraz w zdecydowanej większości badań klinicznych, oligonukleotydy antysensowne były wystarczająco wydajnie pobierane przez komórki w obrębie określonej tkanki, bez stosowania dodatkowych związków kompleksujących. Opisana wyżej sprzeczność wyników pomiędzy badaniami przyżyciowymi a technikami in vitro, wskazuje, że w przypadku poszukiwania nowych leków, wyniki tych ostatnich nie zawsze są przydatne do prognozowania zastosowań klinicznych.
Kontrolowane uruchomienie obecnego w komórkach człowieka mechanizmu RNAi może być bardzo obiecującym sposobem na wyciszenie wybranych genów- tych, których nadmierna ekspresja jest przyczyną występowania jakiegoś schorzenia lub należących do organizmów patogennych. Potwierdzają to liczne badania in vitro oraz prowadzone na organizmach zwierząt laboratoryjnych. Jak wspomniano wyżej, mechanizm RNAi jest uruchamiany za pośrednictwem niskocząsteczkowych siRNA, komplementarnych względem wyciszanego genu. To właśnie siRNA pełnią rolę „przewodnika” doprowadzającego RISC do docelowej cząsteczki mRNA i mogą stanowić substancję czynną leku. Istnieje kilka istotnych przeszkód w klinicznym zastosowaniu RNAi jako jednej z form terapii. Obok wspomnianych trudności z penetracją kwasów nukleinowych przez błony komórkowe, co wynika z ich parametrów fizyko-chemicznych, siRNA dodatkowo mają budowę dwuniciową, i tylko taka ich struktura umożliwia uruchomienie interferencji RNA. Dlatego dwuniciowe siRNA muszą być utworzone na drodze hybrydyzacji pojedynczych nici tuż przed ich podaniem do organizmu pacjenta. Struktura dwuniciowa nie jest elementem trwałym i utworzone siRNA mogą ulegać rozpadowi np. pod wpływem podwyższonej temperatury. Ponadto kwas rybonukleinowy, z którego są zbudowane siRNA jest znacznie bardziej labilny niż DNA i ulega szybkiej degradacji pod wpływem wszechobecnych w środowisku rybonukleaz- enzymów hydrolizujących RNA. Aby temu zaradzić, wprowadza się modyfikacje chemiczne DNA lub RNA. Zdołano opracować jak dotąd kilka sposobów modyfikacji chemicznych cząsteczek siRNA, które mają na celu szeroko pojęte zwiększenie efektywności w warunkach in vivo. Modyfikacje chemiczne cząsteczek siRNA są opisane szczegółowo w pracy Corey i wsp. Pozwalałyby one na: 1.) zwiększenie stabilności termicznej formy dwuniciowej siRNA; 2.) zwiększenie odporności RNA na działanie rybonukleaz; 3.) polepszenie biodystrybucji i penetracji siRNA przez błony komórkowe; 4.) uzyskanie/zwiększenie specyficzności tkankowej oraz 5.) zwiększenie powinowactwa do docelowej sekwencji mRNA. Przy ocenie przydatności techniki RNAi w leczeniu chorób należy nie bez znaczenia pozostaje wysoki koszt syntezy cząsteczek siRNA, szczególnie w dużych ilościach- niezbędnych dla przeprowadzenia terapii. Pozostaje też nierozwiązany jak dotąd problem toksyczności cząstek siRNA w komórkach. Dlatego pomimo teoretycznie wysokiej skuteczności i specyficzności mechanizmu RNAi, metoda ta musi zostać dobrze zoptymalizowana, zanim będzie mogła stanowić jedną z form terapii człowieka.
Wiele opracowań zwraca uwagę na możliwość wykorzystania oligonukleotydów antysensownych (ASO) jako leków. W tym przypadku cząsteczki efektorowe są zbudowane z DNA, który jest znacznie bardziej stabilny od RNA. Dużo niższy jest też koszt syntezy ASO w stosunku do siRNA, również przy dużej skali produkcji. Ponieważ niezmodyfikowane ASO, podobnie jak RNA, ulegają w komórce degradacji przez wewnątrzkomórkowe endo- i egzonukleazy, opracowano wiele modyfikacji chemicznych oligonukleotydów, które zwiększają ich stabilność a także pozwalają na regulowanie mechanizmu ich działania. I tak np. PNA- czyli oligonukleotydy pozbawione szkieletu zbudowanego z rybozy i reszt kwasu fosforowego tworzą bardzo stabilne dupleksy z cząsteczką mRNA i oddziałują wyłącznie na etapie blokowania inicjacji i elongacji transkrypcji, ponieważ nie mają zdolności do aktywowania RNA-zy H. Z kolei oligonukleotydy tiofosforanowe (w których jeden atom tlenu w każdej z reszt kwasu fosforowego został zastąpiony atomem siarki) indukują aktywność RNA-zy H. Szczegółowy opis stosowanych modyfikacji chemicznych ASO zawarty jest w pracy Dias i wsp. [Dias N. i wsp., 2002].
Leki przeciwwirusowe
Jednym z ważnych efektów terapeutycznego działania kwasów nukleinowych może być zwalczanie infekcji wirusowych człowieka. Przewiduje się, że szczególne znaczenie w tym zakresie może mieć mechanizm interferencji RNA, indukowany w organizmie pacjenta poprzez podanie krótkich cząsteczek siRNA. Wykazano już, że technika interferencji RNA jest skuteczny wobec wirusa grypy. W doświadczeniu opisanym przez Wong i wsp. [Wong J.P., 2007] wprowadzenie modyfikowanych dwuniciowych cząsteczek RNA (dsRNA) do organizmu myszy skutecznie chroniło organizm zwierzęcia przed letalnym działaniem różnych szczepów wirusa grypy typu A. Podobny efekt ochronny uzyskiwano po wprowadzeniu do organizmu krótkich oligonukleotydów (siRNA). Ekspresja genów wirusa grypy typu A była też specyficznie inhibowana po podaniu oligonukleotydów antysensownych wiążących cząsteczki mRNA wirusa kodujące kluczowe białka wirusowe. Jako, że uzyskane wyniki są bardzo obiecujące, przewiduje się zastosowanie leków na bazie kwasów nukleinowych równolegle ze znanymi farmaceutykami (w przypadku wirusa grypy np. razem z inhibitorami neuraminidazy lub atenuowanymi szczepionkami). Ponieważ występowanie grypy ma charakter pandemiczny, leki na bazie DNA/RNA mogą być szczególne przydatne w czasie lub na obszarach nasilonego występowania zakażeń wirusem. Duże znaczenie tych leków może też dotyczyć tych szczepów wirusa grypy, które są niebezpieczne dla życia człowieka.
Uważa się, że interferencja RNA może być bardziej skuteczna w odniesieniu do takich wirusów, które wywołują u człowieka zakażenia o charakterze ostrym, których zasięg jest ograniczony do pewnych typów komórek lub tkanek. W przypadku zakażeń ogólnoustrojowych, a szczególnie tych o charakterze przewlekłym, technika RNAi może być mniej skuteczna w działaniu. Dotyczy to zakażeń takimi wirusami jak HIV oraz wirusy zapalenia wątroby typu B i C, aczkolwiek liczne prace również dowodzą wysokiej skuteczności interferencji RNA w hamowaniu ekspresji także tych patogenów [Coburn G.A., 2002, Trejo-Avila L., 2007]. W przypadku chorób wirusowych o charakterze przewlekłym postuluje się doprowadzanie do komórek wektorów ekspresyjnych, których produkty- shRNA (ang. short hairpin RNA) są prekursorami właściwych cząsteczek efektorowych siRNA. Bezpośrednie podawanie cząsteczek siRNA wywołuje efekt przejściowy, zbyt krótkotrwały dla terapii przewlekłych zakażeń wirusowych.
Duże nadzieje wiąże się z zastosowaniem techniki RNAi w terapii nabytego zespołu niedoboru odporności (AIDS), poprzez hamowanie replikacji wirusa HIV. Trudność w leczeniu polega na tym, że ostra faza zakażenia HIV (dogodny moment do wykorzystania techniki RNAi) przebiega w sposób łagodny i objawowo podobny do wielu typowych zakażeń. W kolejnym etapie przebiegu AIDS wirus HIV przemieszcza się do licznych rezerwuarów i komórek w całym organizmie i przechodzi w okres latencji, który może trwać bardzo długo. Z tych powodów mechanizm RNAi stosowany wobec HIV musi mieć działanie długotrwałe (tak jak w innych schorzeniach przewlekłych) a środki terapeutyczne powinny być dostarczane do rezerwuarów wirusa. Dodatkową trudność stanowi charakterystyczne dla HIV zjawisko częstych mutacji i selekcji wirusów lekoopornych oraz występowanie w populacji wielkiej liczby wariantów sekwencji genomowego RNA. Dlatego korzystne może być zastosowanie terapii kombinowanej, obejmującej np. technikę RNAi i rybozymy. Terapia tego typu znajduje się obecnie w I fazie badań klinicznych i bazuje na wektorach lentiwirusowych do ekspresji shRNA i rybozymu [Li M. i wsp. 2006].
Dalsze informacje dotyczące zastosowania interferencji RNA jako leku antywirusowego zamieszczono w artykule dostępnym na portalu biotechnologia.pl [Machnik G.: Mechanizm interferencj RNA w ochronie przeciwwirusowej] oraz w artykule przeglądowym Huang D. [Huang D.D., 2008].
Inny rodzaj leków przeciwwirusowych oparty jest na działaniu oligonukleotydów antysensownych. W chwili obecnej opracowano jeden lek o nazwie Fomivirsen, który ma już zastosowanie kliniczne w leczeniu zapalenia siatkówki wywołanej przez wirus cytomegalii (CMV). Lek jest stosowany u pacjentów z nabytym niedoborem odporności (AIDS).
Oligonukleotydy antysensowne (ASO) o zmodyfikowanej chemicznie budowie cząsteczek wykorzystano w inhibicji genów o dużym znaczeniu w patologii białaczki krwi. W badaniu pilotażowym pacjentom podawano lek zawierający ASO skierowane przeciwko mRNA hematopoetycznego czynnika transkrypcyjnego c-myb. Lek ten zostanie wkrótce wprowadzony do I fazy badań klinicznych, które będą obejmowały dodatkowo pacjentów cierpiących na różne choroby układu krwiotwórczego. Dobre wyniki inhibicji w warunkach in vitro uzyskano przy jednoczesnym zastosowaniu oligonukleotydów anty-c-myb oraz oligonukleotydów skierowanych przeciwko białku sygnałowemu proto-Vav [Gewirtz A.M., 2006]. U pacjentów cierpiących na przewlekłą białaczkę limfocytarną i w terapii czerniaka uzyskiwano dobre wyniki, gdy ASO były skierowane przeciwko mRNA genu Bcl-2. [O’Brien i wsp. 2005].
Wraz z poznaniem funkcji kolejnych genów, których ekspresja skorelowana jest z procesem nowotworzenia rośnie liczba potencjalnych miejsc docelowych dla oligonukleotydów antysensownych, które mogą być wykorzystane w terapii. Szczególnie ważne są przy tym te geny, które w przebiegu choroby nowotworowej ulegają nadekspresji, a więc mogą być przedmiotem inhibicji poprzez terapeutyczne kwasy nukleinowe podane w leku. Brane pod uwagę są też te geny, które pełnią ważną rolę w rozwoju raka, lecz jednocześnie ich funkcjonowanie jest niewrażliwe na działanie dotychczas stosowanych leków. Uważa się, że dla uzyskania optymalnych rezultatów ASO powinny być stosowane równolegle (synergistycznie) z lekami konwencjonalnymi. Poniżej przedstawiono kilka przykładów genów o dużym znaczeniu w patologii nowotworów, do których projektowane są oligonukleotydy antysensowne.
Produkt genu Bcl-2 jest białkiem membrany mitochondrialnej. Tworzy on heterodimery z białkiem Bax oraz z innymi białkami regulatorowymi o działaniu proapoptotycznym. Białko Bcl-2 blokuje uwalnianie cytochromu c z mitochondriów i nie dopuszcza tym samym do uruchomienia procesu apoptozy. Gen Bcl-2 jest docelową sekwencją ASO wykorzystywanych w wielu niezależnych badaniach. Potencjalny lek G3139 (inna nazwa: Genasense) jest preparatem oligonukleotydów o szkielecie tiofosforanowym (a więc o zmodyfikowanej budowie cząsteczki). Stosowane ASO posiadają długość 18 oligonukeotydów i są komplementarne do pierwszych sześciu kodonów w mRNA genu Bcl-2. Docelowo preparat ma być lekiem skierowanym przeciwko różnym typom nowotworów. G3132 został pozytywnie zweryfikowany w badaniach przedklinicznych i osiągną fazę kliniczną badań. Oceniono, że u pacjentów cierpiących na białaczkę (non- Hodgkin’s- lymphoma) maksymalna tolerowana dawka preparatu wynosiła ok. 147 mg/m2/dobę a jedynymi obserwowanymi skutkami ubocznymi był stan zapalny w miejscu iniekcji (preparat był podawany podskórnie) i trombocytopenia, czyli obniżenie liczby trombocytów we krwi. Ten ostatni czynnik był limitujący w ustaleniu tolerowanej dawki leku. Spośród 21 osób objętych badaniami silny efekt terapeutyczny wystąpił u jednego pacjenta, a u dwóch kolejnych osób obserwowano średni efekt działania leku. Tylko u połowy badanych pacjentów poziom białka Bcl-2 w lizacie komórek limfocytów był obniżony na tyle, że możliwe było potwierdzenie zmiany jego poziomu techniką western-blot. Badania te prowadzono bez jednoczesnego stosowania innych leków.
Inne badania kliniczne z zastosowaniem G3139 były prowadzone u pacjentów cierpiących na czerniaka (melanoma) przy jednoczesnym zastosowaniu konwencjonalnych leków przeciwnowotworowych – dakarbazyny (DTIC). W efekcie prac uzyskano nieznaczne tylko przedłużenie okresu przeżywalności pacjentów otrzymujących G3139+DTIC w porównaniu z grupą kontrolną. Dlatego pomimo obiecujących wyników wstępnych efekt kliniczny nie był zadowalający, co potwierdziły też inne badania (opisane szczegółowo w pozycji Gleave i wsp.[Gleave M.E., Monia B.P., 2005]. Z powodu miernych efektów leczniczych preparatu, G3139 nie został zaaprobowany prze Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA).
Wykazano, że w przypadku niektórych nowotworów geny Bcl-2 i Bcl-X ulegają koekspresji i nie można stwierdzić, które z białek pełni krytyczną rolę w procesie przeżywalności komórki. Niektóre źródła wskazują tez na możliwość „przełączania” ekspresji z Bcl-2 na Bcl-X [Han Z. i wsp. 1996]. Oligonukleotydy antysensowne skierowane przeciwko mRNA Bcl-X wykazałyzdolność do indukcji apoptozy w różnych komórkach nowotworowych oraz uwrażliwiały komórki nowotworu na stosowaną chemioterapię. Z kolei w innych typach nowotworów ASO skierowane przeciwko Bcl-X tylko nieznacznie podnosiły wrażliwość komórek na chemioterapeutyki i w niewielkim stopniu opóźniły progresję raka. Ma to miejsce np. w komórkach niezależnego od androgenów raka prostaty. W związku z uzyskaniem obiecujących, lecz zróżnicowanych wyników, zaproponowano równoczesne użycie ASO przeciwko Bcl-2 i Bcl-X i wywołanie ich synergistycznego efektu działania w różnych typach nowotworów. Zastosowane doświadczalnie ASO komplementarne do Bcl-2 wraz z ASO komplementarnymi do Bcl-X zahamowały ekspresję obu genów a przez to indukowały proces apoptozy w kilku typach komórek nowotworowych [Gautschi O. i wsp. 2001]. Wyniki te zachęcają do dalszego poszukiwania kombinacji genów, których jednoczesne wyciszenie może mieć korzystne działanie synergistyczne w terapii nowotworów.
Kinaza białkowa C.
Jest to białko enzymatyczne, którego nadmierna ekspresja koreluje z procesem onkogenezy, wzrostem guzów nowotworowych a także z fenotypem oporności wielolekowej. Dlatego gen kinazy białkowej C (PKC) uważa się za optymalną sekwencję docelową dla zastosowania ASO w leczeniu nowotworów. Badania w tym kierunku prowadzono w warunkach in vitro stosując 20-sto nukleotydowe oligonukleotydy o zmodyfikowanej budowie chemicznej (szkielet tiofosforanowy) o nazwie ISIS 3521. Badania osiągnęły III fazę kliniczną i były prowadzone na grupie pacjentów cierpiących na nowotwór płuc. W zastosowanej terapii preparat ISIS 3521 był podawany pacjentom równolegle z lekami przeciwnowotworowymi carboplatin oraz paclitaxel. W efekcie nie wykazano różnic w procesie rozwoju nowotworu ani w długości okresu przeżywalności pacjentów. Podobnie negatywne rezultaty uzyskano przy połączeniu działania ISIS 3521 z innymi lekami przeciwnowotworowymi (gencitabine i cisplatin). Przypuszczalnie na brak pożądanego efektu leczniczego miało wpływ kilka czynników, takich jak: 1). Zahamowanie ekspresji PKC nie miało dużego wpływu na ogólny wzrost nowotworów w danej populacji. 2). Inhibicja PKC mogła mieć wyłącznie działanie cytostatyczne, które nie było oceniane w opisywanym badaniu. 3.) Wyciszenie ekspresji pojedynczego genu jest niewystarczające dla uzyskania efektu klinicznego, który znacząco przewyższałby efekt uzyskiwany poprzez samą chemioterapię. 4). Zastosowana dawka leku nie była wystarczająca dla efektu biologicznego, w związku z tym inhibicja ekspresji PKC w guzie była niewystarczająca.
Oprócz omówionych wyżej genów, których ekspresja wykazuje korelację z rozwojem nowotworu, badania nad wprowadzeniem ASO jako leku przeciwnowotworowego obejmują również inne sekwencje docelowe. Jest nią np. gen klastryny (CLU), którego produktem jest białko opiekuńcze- chaperonowe o działaniu cytoochronnym. Wykazano zwiększony poziom ekspresji CLU w kilku jednostkach chorobowych, w większości o charakterze nowotworowym. Badania nad zastosowaniem ASO w inhibicji ekspresji klastryny osiągnęły II fazę badań klinicznych. Dawki leku, które opracowano w trakcie I fazy badań są znacznie wyższe niż w opisywanych wyżej preparatach ASO G 3139 oraz ISIS 3521. Ma to zapewnić optymalny poziom stężenia ASO wymagany do aktywności biologicznej.
Inne geny, które są obecnie przedmiotem prac nad zastosowaniem ASO w leczeniu nowotworów opisano szczegółowo w pracy przeglądowej Greave and Monia [Gleave M.E., Monia B.P., 2005].
Wprowadzenie oligonukleotydów antysensownych do terapii może pozwolić na regulację gospodarki tłuszczowej człowieka. Wykazano wysoką wydajność inhibicji genu kodującego apolipoproteinę B100. Białko to jest syntetyzowane w wątrobie- do której cząsteczki ASO mają wysokie powinowactwo. Dlatego stosunkowo łatwo można uzyskać znaczne stężenia preparatu w komórkach tego organu. W badaniach uzyskano duży spadek ekspresji apolipoproteiny B100 i związany z tym spadek ilości cholesterolu LDL w surowicy krwi. Badania prowadzono na ochotnikach. Nie wykazano znaczących skutków ubocznych, a te, które występowały, obejmowały reakcje miejscowe w miejscu iniekcji oraz nieznaczne odchylenia od normy w przeprowadzonych testach wątrobowych. Autorzy podkreślają jednak, że grupa badana była stosunkowo niewielka i wymagane są jeszcze dodatkowe badania kliniczne [Akdim F. i wsp., 2007].
Do terapii człowieka wprowadzane są też rybozymy. Są to np. syntetyczne rybozymy, które specyficznie przecinają sekwencję mRNA kodującą receptor dla naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu. Czynnik ten jest odpowiedzialny za proces waskularyzacji guza, więc zahamowanie jego funkcji ma działanie przeciwnowotworowe poprzez zablokowanie dopływu krwi.
W pracy przyjęto następujący system zapisu nazw genów i białek:
(na podstawie Chorąży M. List do redakcji. Postępy Biologii Komórki 1998; 25 supl. 10):
Geny wirusów oraz zwierząt: Małe litery, kursywa, np. env
Geny ludzkie: Duże litery, kursywa, np. BCL-2
Białka wirusów i zwierząt: Pierwsza litera symbolu dużą literą, pismo proste, np. Ras
Białka ludzkie: Duże litery, pismo proste, np. TNF
Piśmiennictwo: Cytowane pozycje literatury są dostępne u autora pracy.
Grzegorz Machnik
Absolwent kierunku Biotechnologia Akademii Rolniczej w Poznaniu. Obecnie asystent w Zakładzie Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. Tematyka pracy doktorskiej i zainteresowania naukowe dotyczą głównie endogennych retrowirusów świni (PERV), ich struktury genetycznej i potencjału infekcyjnego w aspekcie ksenotransplantacji.
Śląski Uniwersytet Medyczny, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej
Adres do korespondencji: ul. Narcyzów 1, 41-200 Sosnowiec, Tel. (32) 364 10 02, e-mail: gmachnik@sum.edu.pl
KOMENTARZE