VBNC (ang. Viable But Not Culturable) czyli żywe lecz niehodowalne mikroorganizmy to termin kojarzący się głównie z gatunkami środowiskowymi, których nie jesteśmy w stanie namnożyć w standardowych warunkach laboratoryjnych ze względu na ich specyficzne wymagania wzrostowe. Zastosowany po raz pierwszy w 1982 roku, obejmuje szacunkowo 99% wszystkich gatunków mikroorganizmów na Ziemi. W świetle ostatnich badań okazuje się jednak, że forma VBNC dotyczy także gatunków powszechnie znanych, w tym większości patogenów człowieka o znaczeniu klinicznym, takich jak Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli czy Klebsiella pneumoniae. Zjawisko to opisywane jest jako stan fizjologiczny (fenotyp) osiągany na skutek niesprzyjających warunków środowiska, na przykład podczas stosowanej antybiotykoterapii. Stwarza to poważne trudności w określeniu właściwej liczby komórek w testach diagnostycznych z użyciem standardowych metod płytkowych.
Komórki VBNC różnią od swoich „żywotnych” odpowiedników pod względem morfologii, składu błony i ściany komórkowej, ekspresji specyficznych genów, odpornością na czynniki fizyczne i chemiczne, a także zdolnością adhezji i wirulencją. Formy VBNC, w przeciwieństwie do komórek martwych, pozostają aktywne metabolicznie między innymi przeprowadzając proces oddychania i produkując ATP. Na skutek korzystnej zmiany warunków środowiska, indukowane formy VBNC mogą powrócić do formy hodowalnej na drodze tak zwanej resuscytacji. Jest to zatem stan przejściowy, który dla wielu patogenów człowieka został zdefiniowany pod względem czynników indukujących wejście w stan VBNC, warunków resuscytacji oraz tak zwanego okna resuscytacji – czyli czasu, w którym komórki VBNC zachowują zdolność do powrotu do stanu hodowalnego. Przykładowe parametry stanu VBNC dla wybranych patogenów człowieka zawarte są w poniższej tabeli.
Wybrane gatunki, dla których opisano stan VBNC.
|
Gatunek |
Warunki indukujące stan VBNC |
Warunki resuscytacji |
Okno resuscytacji |
|
Enterococcus faecalis |
Głód, niska temperatura |
Bogata pożywka połączona ze wzrostem temperatury; zapłodnione jaja kurze |
60 dni |
|
Escherichia coli |
Głód; światło; stres oksydacyjny; wysoka temperatura; chlorynacja |
Bogata pożywka z autoinduktorem enterobakteryjnym; pożywka minimalna z dodatkiem aminokwasów; supernatant z aktywnie rosnącej hodowli; wzrost temperatury |
nieznane |
|
Mycobacterium tuberculosis |
Głód; stres okydacyjny |
Bogata pożywka z dodatkiem katalazy |
3,5 miesiąca |
|
Salmonella Enteritidis |
Głód |
Bogata pożywka |
< 21 dni |
Brzmi znajomo…
Czy jednak opisane wyżej zjawisko nie brzmi jakoś znajomo? Jakkolwiek trudno jest przywołać polską nazwę, podobną strategię przetrwania obierają tak zwane „persister cells”. Podobnie jak forma VBNC, jest to subpopulacja komórek zdolnych do przetrwania w warunkach działania antybiotyków. Obecność persister cells najlepiej obrazuje zmiana nachylenia krzywej przeżywalności hodowli w obecności antybiotyku, która nie jest zależnością liniową – po zabiciu większości komórek w hodowli następuje powolne zabijanie komórek, które przetrwały początkowy okres działania antybiotyku, czyli właśnie persister cells.
Ref. Ayrapetyan et al. 2015
Po usunięciu niesprzyjającego czynnika, niewielka ilość przetrwałych komórek odtwarza wyjściową populację. Tak jak w przypadku VBNC, persister cells zachowują podstawową aktywność metaboliczną przy spowolnionych funkcjach życiowych i odmiennym stanie fizjologicznym od normalnych komórek. Zasadne wydaje się więc pytanie: czy badając formy VBNC i persister cells nie patrzymy na to samo?
Podobieństwa i różnice
VBNC i persister cells, ze względu na niemal identyczną fizjologię i morfologię, jest niezwykle trudno rozróżnić w hodowli. Obie formy są rodzajem strategii przetrwania niekorzystnych warunków środowiska, które de facto nie prowadzą do wytworzenia oporności, lecz służą utrzymaniu wyjściowej populacji. Termin „persister cells” stosowany jest jedynie w odniesieniu do działania antybiotyku, podczas gdy formy VBNC, oprócz antybiotyków, tolerują także takie warunki jak obecność metali ciężkich, niesprzyjające pH, stres oksydacyjny i osmotyczny itp. Czy persister cells nie są więc jedną z odmian VBNC? To pytanie nie umknęło badaczom, którzy jako podstawową różnicę pomiędzy tymi dwoma formami przyjmują fakt, iż persister cells, w odróżnieniu od form VBNC, są w stanie odtworzyć wyjściową populację w podstawowej pożywce, jedynie po usunięciu antybiotyku. VBNC natomiast, do zajścia procesu resuscytacji wymagają bogatych podłóż i dodatkowych czynników wzrostowych. Definicja ta jest jednak bardzo zgrubna, ponieważ znane są także inne czynniki promujące przejście formy VBNC w formę żywotną, a dla wielu gatunków warunki te do dziś pozostają niezdefiniowane. Dla pełnego rozróżnienia bądź ujednolicenia tych dwóch zjawisk potrzeba dogłębnej analizy markerów molekularnych. Istniejące doniesienia, jako wspólny element istotny zarówno przy przejściu w stan VBNC jak i persister cells, wskazują akumulację ppGpp (czterofosforan guanozyny) – cząsteczki sygnałowej zwanej alarmonem, hamującej proces translacji bakteryjnej w warunkach stresu. Istniejąca ilość opisanych dotąd markerów molekularnych jest jednak niewystarczająca, by jednoznacznie określić różnice pomiędzy tymi dwoma formami. Odpowiedź na to pytanie z pogranicza filozofii i biologii jest istotna w kontekście skutecznego leczenia infekcji bakteryjnych. Aby ją znaleźć, potrzeba większej ilości badań i przede wszystkim otwartości na inny punkt widzenia.
Literatura:
1. Amato SM, Fazen CH, Henry TC, Mok WWK, Orman MA, Sandvik EL, Volzing KG and Brynildsen MP (2014) The role of metabolism in bacterial persistence. Front. Microbiol. 5:70
2. Li L, Mendis N, Trigui H, Oliver JD and Faucher SP (2014) The importance of the viable but non-culturable state in human bacterial pathogens. Front. Microbiol. 5:258.
KOMENTARZE