Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Usprawniony Western-Blot?
Usprawniony Western-Blot?
Naukowcy opracowali metodę wykonania analizy western blot w pojedynczej komórce! Technika ma umożliwić określenie różnic w ekspresji białek pomiędzy poszczególnymi komórkami w tej samej tkance. W tym samym czasie można przeanalizować 2 tysiące pojedynczych komórek, a cała procedura potrwa mniej niż 4 godziny.

W standardowym protokole western-blot można wyróżnić następujące etapy: 1) izolacja białek z określonej tkanki; 2) elektroforetyczny rozdział wyizolowanych białek ze względu na ich masę bądź ładunek; 3) przeniesienie protein na membranę (np. nitrocelulozową); 4) znakowanie białek przy pomocy przeciwciał. Przeprowadzona w ten sposób analiza dostarcza informacji na temat obecności i stężenia poszczególnych białek w badanej tkance bądź grupie komórek. A co zrobić, jeśli chcemy porównać profil białkowy pojedynczych komórek, ponieważ mamy w tej samej tkance zarówno komórki zdrowe jak i chore? Z pomocą przyjść może nowa technika opracowana przez grupę naukowców z Berkeley. Badacze stworzyli protokół pozwalający na wykonanie analizy western-blot z pojedyczej komórki!

 

Technika, zwana scWestern (ang. single-cell Western-Blot), umożliwi porównanie profili białkowych w komórkach, które są na różnym etapie rozwoju; pozwoli na analizę komórek macierzystych w trakcie ich różnicowania się; a także może być użyteczna przy porównywaniu komórek chorych ze zdrowymi lub monitorowaniu miejscowej odpowiedzi organizmu na określony farmaceutyk. Autorzy pracy opublikowanej w Nature Methods podkreślają, że są w stanie w tym samym czasie przeprowadzić analizę białek w 2 tysiącach pojedynczych komórek, a cała procedura zajmie im mniej niż 4 godziny.

 

Jak to wygląda od strony praktycznej? Do przeprowadzenia analizy potrzebne jest szkiełko podstawowe (mikroskopowe) pokryte cienką warstwą światłoczułego poliakrlamidu. Na powierzchni żelu (poliakrylamidu) znajduje się matryca składająca się z ponad 6-ciu tysięcy mikroskopowych studzienek o średnicy 20 µm. W studzienkach umieszcza się pojedyncze komórki, a następnie dokonuje tam ich lizy. Po lizie komórek przykłada się do układu napięcie elektryczne w celu przeprowadzenia elektroforetycznego rozdziału uwolnionych białek. Następnie białka zostają unieruchomione w żelu, gdzie inkubuje się je z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami. Cała matryca ze studzienkami podzielona jest na bloki w taki sposób, że do poszczególnych bloków można dodać różne roztwory przeciwciał. Dzięki temu, w tym samym czasie, można uzyskać informacje o więcej niż jednym ze znajdujących się w komórkach białek. Analizy białek z przyłączonymi przeciwciałami dokonuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Schemat całego procesu przedstawiony jest na poniższej ilustracji.

Protokół analizy przy pomocy scWestern. Poszczególne etapy to: rozmieszczenie komórek w studzienkach, liza komórek, elektroforeza, immobilizacja białek i znakowanie przeciwciałami.

Źródła

Single-cell western blotting, Nature Methods 2014

KOMENTARZE
Newsletter