Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Nowa technika pozwala zidentyfikować białka biorące udział w odpowiedzi immunologicznej
Nowa technika pozwala zidentyfikować białka biorące udział w odpowiedzi immunologicznej
Pomimo intensywnego rozwoju narzędzi proteomiki, badanie białek błonowych, a w szczególności ich agregatów, pozostaje zadaniem niezwykle skomplikowanym. Naukowcy z Uniwersytetu w Cambridge oraz Instytutu Biofizyki w Beijing poczynili kroki w celu usprawnienia tego procesu.

Limfocyty B są grupą komórek wysyłanych przez nasz organizm na front w razie infekcji wirusowej bądź bakteryjnej. Mają za zadanie rozpoznać wroga i rozpocząć wydzielanie przeciwciał. Kluczowym elementem biorącym udział w rozpoznawaniu antygenu jest jeden z receptorów występujących na powierzchni limfocytów B – tak zwany receptor komórek B (BCR, ang. B cell receptor). W momencie związania antygenu następuje aktywacja tego receptora, która w następstwie uruchamia szereg kolejnych procesów, takich jak włączenie szlaków przekazu sygnału prowadzących do podziału lub śmierci komórek. Wiadomo, że aktywny receptor komórek B wiąże się innymi białkami prowadząc do powstania swoistych agregatów białkowych. Szczegóły tego procesu nie są jednak poznane, tak samo jak niezidentyfikowane są jak dotąd poszczególne białka biorące w nim udział. Wynika to z tego, że badanie agregatów białkowych, szczególnie tych tworzonych przez białka błonowe, nie należy do zadań trywialnych. Jak dotąd nie znano skutecznej metody aby takie białka wyizolowac i scharakteryzować. Oddziaływania pomiędzy białkami w tego typu agregatach są na tyle słabe, że podczas izolacji takie agregaty po prostu się rozpadają.

Tymczasem w  najnowszym numerze Journal of Biological Chemistry ukazała się publikacja naukowców z Uniwersytetu w Cambridge oraz Instytutu Biofizyki w Beijing w Chinach, w której opisano nową metodę, dzięki której można oznakować białka wchodzące w skład agregatu. Następnie izoluje się je z ekstraktu komórkowego właśnie przy pomocy wprowadzonego znacznika oraz identyfikuje przy zastosowaniu spektrometrii mas. Metoda opiera się na strategii znakowania zbliżeniowego (ang. proximity labeling assay), co oznacza, że tylko cząsteczki znajdujące się w bezpośrednim sąsiedztwie uwolnionego znacznika mogą zostać przez niego zmodyfikowane. Jak taki proces wygląda krok po kroku?

Do komórek wprowadza się przeciwciała sprzężone z enzymem – peroksydazą chrzanową (HRP). W tym przypadku przeciwciała skierowane były przeciwko immunoglobulinie M (IgM) występującej na powierzchni limfocytów B. Drugą cząsteczką wprowadzaną do komórek jest biotyna, połączona za pomocą mostka dwusiarczkowego z innym odczynnikiem chemicznym – tyramidem. Po związaniu się przeciwciała z immunoglobuliną M, w obecności nadtlenku wodoru i peroksydazy, następuje rozerwanie wiązania disulfidowego i utlenienie łańcucha łączącego tyramid z biotyną do formy wolnorodnikowej. Biotyna w takiej formie ma zdolność przyłączania się do białek np. poprzez ich reszty tyrozynowe. Ze względu na krótki czas życia rodnika, oznakowane zostają tylko te białka, które znajdują się w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca, w którym zaszła reakcja. Następnie przeprowadza się lizę komórek, a po niej biotynylowane białka oddzielane są od pozostałych za pomocą chromatografii powinowactwa z wykorzystaniem streptawidyny. Wyizolowane w ten sposób proteiny identyfikuje się dzięki spektrometrii mas. Naukowcy nazwali swoją metodę SPPLAT – ang. Selective Proteomic Proximity Labeling Assay Using Tyramide.

 

Protokół SPPLAT. A) Struktura biotyny połączonej z tyramidem za pomocą mostka dwusiarczkowego. B) Schemat oznaczania białek biotyną w metodzie znakowania zbliżeniowego.

Protokół SPPLAT. A) Struktura biotyny połączonej z tyramidem za pomocą mostka dwusiarczkowego. B) Schemat oznaczania białek biotyną w metodzie znakowania zbliżeniowego.

 

W wyniku przeprowadzonego eksperymentu naukowcom udało się zidentyfikować grupę białek sprzężonych z receptorem komórek B w przypadku uruchomienia odpowiedzi immunologicznej. Część z tych białek już wcześniej kojarzono z receptorem BCR (np. integryny lub białko chB6). „Nasza metoda ma szansę wzbudzić zainteresowanie dużej grupy naukowców, zarówno w społecznościach akademickich jak i przemysłowych. Wynika to z tego, że w biologii molekularnej istnieje wiele procesów, których zrozumienie możliwe jest tylko poprzez identyfikację białek grupujących się na powierzchni komórki. Nasza metoda może zostać zastosowana właśnie w takich przypadkach” – podsumowuje badanie jeden z jego liderów, profesor Antoni Jackson z Wydziału Biochemii na Uniwersytecie w Cambridge. Naukowcy mają również nadzieję, że ich praca przyczyni się do lepszego zrozumienia procesów zachodzących podczas odpowiedzi immunologicznej organizmu, a co za tym idzie, do identyfikacji nowych celów farmakologicznych.

Źródła
  1. New Insights into the DT40 B Cell Receptor Cluster Using a Proteomic Proximity Labeling Assay, The Journal of Biological Chemistry, 2014
  2. B-cell receptor: from resting state to activate, Immunology 2012
  3. Biochemical and proteomic approaches for the study of membrane microdomains, Journal of Proteomics 2009
  4. University of Cambridge, http://www.cam.ac.uk/research
KOMENTARZE
Newsletter