Na początek kilka definicji i wyjaśnień:
Faza stała: jest to zazwyczaj 96-dołkowa, zakupiona płytka. To na niej opłaszcza się rozcieńczone w buforze antygeny lub przeciwciała. Po opłaszczeniu należy zablokować niezajęte miejsca poprzez dodanie np.: odtłuszczonego mleka lub owoalbuminy (ma to na celu zablokowanie nieselektywnego przyłączania się białek do płytki)
Antygen (Ag): związek, który wywołuje reakcję immu nologiczną w organizmie lub bardziej ogólnie - związek, który może być wykryty za pomocą swoistych przeciwciał
Przeciwciało (Ab): glikoproteiny wytwarzane w odpowiedzi na czynnik antygenowy
Enzym: związek, który działa w bardzo małych stężeniach jako katalizator specyficznych reakcji
Enzymy stosowane w teście ELISA musza spełniać pewne warunki:
- muszą łatwo łączyć się z białkiem
- muszą być rozpuszczalne i stabilne w warunkach reakcji
- nie jest wskazanym, aby występowały naturalnie w płynach biologicznych
- substrat dla tych enzymów powinien być łatwo dostępny, a produkt tej reakcji powinien być barwny
Najczęściej stosowane enzymy:
- peroksydaza chrzanowa (HRP=POX)
- fosfataza alkaliczna (AP)
- oksydaza glukozowa (GO)
Substrat: związek, z którym enzym reaguje w sposób specyficzny
Chromogen: związek, który zmienia kolor w wyniku reakcji enzymu z substratem
Peroksydaza chrzanowa katalizuje rozkład nadtlenku wodoru (substrat), a reakcja ta nie jest o widoczna, dlatego do jej uwidocznienia niezbędnym jest dodanie chromogenu. Chromogen oddaje elektrony i przechodzi z postaci bezbarwnej w postać barwną, a im dłużej trwa reakcja, tym większa ilość cząsteczek bezbarwnych przechodzi w postać barwną (zatem zwiększa się natężenie produktu barwnego). Wynik odczytuje się spektrofotometrycznie.
Przykłady chromogenów:
ABTS: Zmienia się z formy bezbarwnej w zieloną (po zatrzymaniu reakcji: barwa zielona). Odczyt przy długości fali: 405nm
TMB: Zmienia się z formy bezbarwnej w niebieską (po zatrzymaniu reakcji: barwa żółta). Odczyt przy długości fali: 450nm.
OPD: Zmienia się z formy bezbarwnej w żółtą. Odczyt przy długości fali: 460nm
Test ELISA może być przeprowadzony w kilku wariantach:
a) Test bezpośredni
Płytka jest opłaszczana antygenem. Następnie dodawane są przeciwciała specyficzne dla antygenu i odpowiednio znakowane enzymem, przeprowadza się inkubację. W tym czasie przeciwciała specyficznie łączą się z antygenem, a te niezwiązane są wymywane. Roztwór substrat/chromofor jest dodawany na płytkę, a enzym katalizuje reakcję i możemy zaobserwować barwny produkt. Dokonujemy spektrofotometrycznego pomiaru.
Zalety:
Szybka i prosta metoda
Wady:
W celu wykrycia różnych Ag, potrzebne są różne znakowane Ab, a wiązanie chemiczne enzymu do Ab może osłabić wiązanie Ab do Ag
b) Test pośredni
Płytka jest opłaszczana antygenem. Następnie dodaje się przeciwciała pierwszorzędowe, które podczas inkubacji wiążą się specyficznie z antygenem. Przeciwciała niezwiązane są wymywane. W kolejnym kroku dodaje się przeciwciała drugorzędowe znakowane enzymem, które łączy się z przeciwciałem pierwszorzędowym na zasadzie rozpoznania izotypu. Nadmiar przeciwciał zostaje wymyty. Roztwór substrat/chromofor jest dodawany na płytkę, a enzym katalizuje reakcję i możemy zaobserwować barwny produkt. Dokonujemy spektrofotometrycznego pomiaru.
Zalety:
Ab pierwszorzędowe nie jest znakowane, dlatego nic nie zaburza jego wiązania się z Ag.
W celu wykrycia różnego typu Ag można użyć różnych nieznakowanych Ab (specyficznych względem antygenu), ale jednocześnie Ab pierwszorzędowe mogą łączyć się zawsze z tymi samymi wyznakowanymi Ab
c) Sandwich ELISA
Płytka opłaszczana jest przeciwciałami, których nadmiar jest wymywany. Następnie dodajemy antygen, który jest „wyłapywany” przez związane na powierzchni płytki przeciwciała. Później dodajemy roztwór z przeciwciałami pierwszorzędowymi, które także łączą się z antygenem, wypłukujemy ich nadmiar, a na końcu dodajemy przeciwciała drugorzędowe, wyznakowane enzymem. Roztwór substrat/chromofor jest dodawany na płytkę, a enzym katalizuje reakcję i możemy zaobserwować barwny produkt. Dokonujemy spektrofotometrycznego pomiaru.
Testu Sandwich ELISA można używać do ilościowego wyznakowania antygenów.
Podstawowe warianty testu ELISA (Ag-antygen, S-substrat, E-enzym, RB- reakcja barwna)
d) kompetycyjny test ELISA
Płytka opłaszczana jest antygenem. Później dodaje się zarówno surowicę jak i specyficzne wobec antygenu przeciwciało wyznakowane enzymem. Nastąpi wtedy współzawodnictwo pomiędzy przeciwciałami pochodzącymi z surowicy a przeciwciałami wyznakowanymi. W ten sposób określić można ilość przeciwciał w surowicy (im mniej przeciwciał wyznakowanych połączy się z antygenem, tym słabszą reakcję barwną zaobserwujemy).
Można także zastosować wariant odwrotny, kiedy to płytka jest opłaszczana przeciwciałem i wtedy następuje rywalizacja o wiązanie do przeciwciała pomiędzy antygenem wyznakowanym, a antygenem pochodzącym z materiału, który poddajemy analizie.
Za pomocą testu ELISA możemy wykryć zarówno obecność antygenów, jak i przeciwciał w próbce, zatem wykorzystuje się go w testach na obecność wirusa HIV, toksoplazmozy, w badaniach żywności na obecność określonych alergenów (np.: orzechów lub mleka). Można przy jego pomocy wykryć wiele chorób, m.in.: malarię czy chorobę Chagasa.
KOMENTARZE