Przyczyny niepłodności mogą zależeć  zarówno od kobiety, jak i mężczyzny, a w wielu przypadkach problem współistnieje u obu partnerów. Poważnym zagrożeniem jest coraz mniejsza płodność kobiet, będąca wynikiem podwyższenia granicy wiekowej przy podejmowaniu decyzji o posiadaniu potomstwa. Główną przyczyną związanego z wiekiem spadku płodności jest wzrost nieprawidłowości genetycznych zachodzących w starzejących się komórkach jajowych.  Zwiększa to  odsetek  poronień oraz  ryzyko wad wrodzonych u potomstwa. Płodność kobiety obniża się nieznacznie już około 20. roku życia, a wyraźne jej obniżenie obserwuje się około 35. roku życia w  związku  z gwałtownie zmniejszającą się liczbą pęcherzyków pierwotnych w jajniku. Ryzyko poronienia rozpoznanego, jak i nierozpoznanego u kobiet po 40. roku życia szacuje się na około 75%, podczas gdy przed 30. rokiem życia nie przekracza  7–15% [1]. Proces rozmnażania, wbrew pozorom, charakteryzuje się małą wydajnością. Dane literaturowe wskazują, że aż  30-50%  ciąż kończy się samoistnym poronieniem przed końcem pierwszego trymestru ciąży, przy czym większość z nich zdarza się  już w czasie implantacji zarodka. Poronienia samoistne występują u 0,5-3% kobiet w rozrodczym przedziale wiekowym, z czego ponad połowę  określa się  poronieniami o nieznanej przyczynie – tzw. idiopatycznymi [2]. Do najczęstszych przyczyn niepłodności żeńskiej należą: zaburzenia owulacji, niedrożność jajowodów, wrodzone i nabyte nieprawidłowości budowy narządu płciowego, zakażenia, endometrioza. Za jedną z ważnych przyczyn zaburzeń związanych z niepłodnością uważa się występowanie stresu oksydacyjnego.

Gdy reaktywnych form tlenu jest więcej niż antyoksydantów

Stres oksydacyjny jest wynikiem nadmiernej aktywności RFT zachodzącej na skutek zachwiania równowagi między ich powstawaniem i usuwaniem przez systemy antyoksydacyjne. Wśród RFT istotne znaczenie ma anionorodnik ponadtlenkowy (O2.–) oraz produkty jego konwersji, takie jak: nadtlenek wodoru (H2O2), rodnik hydroksylowy (OH.) oraz nadtlenoazotyn (ONOO–), który jest reaktywną formą azotu (RFA). RFT i RFA szybko wchodzą w reakcje, w tym łańcuchowe, reagują z białkami, lipidami, cukrami i kwasami nukleinowymi obecnymi w komórkach, prowadząc do powstania wtórnych produktów wolnorodnikowych. Reaktywne formy tlenu są produktami metabolizmu tlenowego zachodzącego w komórkach w warunkach fizjologicznych. Organizmy żywe wytwarzają RFT w wielu podstawowych procesach biochemicznych, takich jak: łańcuch oddechowy, metabolizm nukleotydów purynowych, mikrosomalny cykl hydroksylacyjny (cytochrom P-450) czy cykl przemian kwasu arachidonowego (szlak cyklooksygenazy i lipooksygenazy). Produktem tych reakcji jest najczęściej anionorodnik ponadtlenkowy lub nadtlenek wodoru. W warunkach homeostazy, reaktywne formy tlenu odgrywają rolę mediatorów i regulatorów wielu procesów komórkowych [3] . RFT są odpowiedzialne  za różnicowanie i apoptozę komórek, wpływają na syntezę, uwalnianie lub inaktywację tlenku azotu oraz pobudzają transport glukozy do komórek. Poprzez zwiększanie przepuszczalności ścian naczyń włosowatych warunkują prawidłowy przebieg reakcji zapalnej. RFT biorą też udział w regulacji procesów przekazywania sygnałów z komórki do komórki oraz w jej obrębie. Anionorodnik ponadtlenkowy oraz nadtlenek wodoru ze względu na małą reaktywność, selektywność oraz stałą dostępność w komórce są dobrymi przekaźnikami informacji np. w szlaku cyklazy adenylanowej czy fosfolipazy C [3]. RFT mogą również  uczestniczyć  w hamowaniu funkcji receptorów, głównie tych, które zawierają grupy -SH. Większość białek zawierających grupy tiolowe jest inaktywowana przez RFT, ale znane są też białka, których aktywność w ich obecności wzrasta. Do takich białek zalicza się m.in. cyklazę guanylanową oraz 5-lipooksygenazę, będącą źródłem wolnych rodników generowanych przez pobudzone limfocyty. Enzym ten utlenia wielonienasycone kwasy tłuszczowe, a powstające metabolity utrzymują wewnątrzkomórkową równowagę oksydacyjną aktywując szlaki przekazywania sygnału i ekspresję genów [4]. Wolne rodniki  są wytwarzane przez komórki fagocytujące (granulocyty, monocyty i makrofagi) i wykorzystywane do eliminacji patogenów. Zjawisko to, zwane „wybuchem tlenowym” jest związane  z kilkudziesięciokrotnym wzrostem zużycia tlenu i wykorzystaniem go do wytworzenia i uwolnienia dużych ilości anionorodnika ponadtlenkowego – prekursora jonu hydroksylowego. RFT uczestniczą również w eliminacji pasożytów oraz czynników potencjalnie chorobotwórczych pojawiających się w jamie ustnej. Wyniki badań wskazują, że reaktywne formy tlenu mają udział w regulacji procesów immunologicznych. RFT zwiększają aktywację limfocytów T oraz indukują ich adhezję do śródbłonka, dzięki  temu możliwe jest ich przenikanie z układu krążenia do miejsca reakcji zapalnej [4]. Regulatorowe działanie H2O2 w niskich stężeniach przejawia się także w aktywacji czynnika jądrowego NF-қB, pełniącego rolę aktywatora ekspresji wielu genów. Geny znajdujące się pod kontrolą tego czynnika kodują np. cytokiny (IL-1b czy IL-6), białka odpornościowe, tioredoksynę oraz dysmutazę ponadtlenkową [5].              

Wpływ wolnych rodników tlenowych na komórki zależy w dużym stopniu od ich stężenia i czasu działania. W małych stężeniach RFT pełnią funkcje fizjologiczne, wyższe stężenia są toksyczne dla komórek i  powodują  ich uszkodzenie. Im większą reaktywnością odznacza się utleniacz, tym jest  mniej wybiórczy w stosunku do cząsteczek będących jego celem [6]. Badania dowodzą, że reaktywne formy tlenu biorą udział w etiologii wielu schorzeń, mają też wpływ na cykl reprodukcyjny kobiet, oddziaływają nań przez cały okres życia. Występowanie zjawiska stresu oksydacyjnego obserwuje się w  nawracających poronieniach,  poronieniach o charakterze idiopatycznym, zaburzeniach  embriogenezy oraz w rozwoju płodu [1].

Znaczenie RFT w funkcjonowaniu układu rozrodczego kobiety

Dane literaturowe wskazują, że reaktywne formy tlenu w niewielkich stężeniach są niezbędne do  prawidłowego funkcjonowania żeńskiego układu rozrodczego. RFT jako cząsteczki sygnałowe mają wpływ na wiele procesów fizjologicznych, w tym na zachowanie cykliczności menstruacji i apoptozę komórek jajowych. Mogą też pełnić regulatorową funkcję w dojrzewaniu oocytu, folikulogenezie czy luteolizie [7]. Obecność reaktywnych form tlenu wykryto w płynie pęcherzykowym, oocytach i zarodkach. Stwierdzono także ekspresję genów  dysmutazy ponadtlenkowej i peroksydazy glutationowej w oocytach i jajowodach [8]. W prawidłowo funkcjonującym jajniku wykazano obecność dysmutazy ponadtlenkowej, peroksydazy glutationowej oraz produktów peroksydacji lipidów [7]. Badania wykazały, że do właściwego funkcjonowania oocytu i osiągnięcia jego dojrzałości niezbędna jest obecność tlenu [9,10]. Zaobserwowano nieprawidłowości w  rozwoju komórek jajowych, w środowisku których stężenie tlenu było mniejsze niż 5%. Warto dodać, że obecność reaktywnych form tlenu i antyoksydantów w endometrium obserwowano zarówno w ciągu całego cyklu menstruacyjnego, jak i w czasie ciąży. Chociaż obecność RFT w kobiecych drogach rodnych została potwierdzona w wielu pracach naukowych, dokładne określenie źródła ich powstawania i znaczenie nadal nie jest wyjaśnione.

Negatywne skutki nadmiernego wytwarzania RFT w żeńskim układzie rozrodczym

Badania prowadzone przez naukowców wykazały znaczne zmiany w mitochondriach oocytów spowodowane przez stres oksydacyjny [11]. Mitochondria to jedyne organelle, poza jądrem komórkowym, które  mają własny, kolisty DNA (mtDNA). W warunkach, w których stężenie reaktywnych form tlenu w  organellach jest zwiększone, np. w wyniku gwałtownego wzrostu stężenia jonów Ca 2+ w macierzy mitochondrium lub w wyniku upośledzenia mechanizmów antyoksydacyjnych, dochodzić może do nieodwracalnego uszkodzenia mitochondrialnego DNA, peroksydacji ich dwuwarstwy lipidowej oraz uszkodzenia białek. Zmiany  prowadzą do całkowitej dysfunkcji mitochondriów i ostatecznie do śmierci komórki. Wzrost stężenia RFT wpływa na zwiększenie wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia, wywołując napływ jonów Ca 2+ do komórki oraz ich uwalnianie z rezerw komórkowych. Zwiększenie stężenia  jonów Ca 2+  uaktywnia  zaś zależne od jonów endonukleazy, które są odpowiedzialne za degradację materiału genetycznego. DNA mitochondriów jest pozbawiony  histonów, co zwiększa jego podatność na uszkodzenia,  tym bardziej że w organellach tych reaktywne formy tlenu  są wytwarzane w dużych ilościach (m.in. przez wyciek jednoelektronowy podczas łańcucha oddechowego). W wyniku dysfunkcji mitochondriów, RFT przedostają się do wnętrza komórki jajowej, powodując jej uszkodzenia. Uszkodzenie DNA komórki płciowej ma ogromny  wpływ na  zapłodnienie i  jego powodzenie  na zachodzącą w późniejszym czasie embriogenezę. Ze względu na to, iż organelle są centrum metabolicznym komórki, wszelkie zaburzenia w ich funkcjonowaniu mogą powodować spadek stężenia ATP, co ostatecznie zaburza także procesy metaboliczne w komórkach jajowych. Uszkodzenie komórek jajowych, przez indukowanie apoptozy, może być także spowodowane działaniem H₂O₂. W uszkodzonych zarodkach, w których wykryto obecność fragmentów cytoplazmy uszkodzonych blastomerów, stwierdzono  nasilony proces programowanej śmierci komórki wywołanej działaniem nadtlenku  wodoru [12]. Uszkodzenia komórek jajowych mogą być także wynikiem nasilonego stresu oksydacyjnego występującego u starszych kobiet. Wraz ze starzeniem się organizmu i komórek jajowych zauważono znaczny spadek stężenia ATP, GSH oraz wzrost stężenia jonów wapnia w cytoplazmie. Konsekwencją tych zmian może być uszkodzenie włókien cytoszkieletu komórki jajowej, upośledzenie jej zdolności do zapłodnienia czy wady wrodzone zarodka, jeśli dojdzie do zapłodnienia takiej komórki [12].

Zaburzenie równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej organizmu może także  spowodować niepłodność o niezidentyfikowanej etiologii. W osoczu kobiet, u których zdiagnozowano ten typ niepłodności, a także kobiet z nawracającymi poronieniami, stwierdzono obniżone stężenie kwasu askorbinowego, α-tokoferolu i GSH, natomiast zarówno w osoczu, jak i w płynie pęcherzykowym w obu grupach kobiet wykazano niższy poziom grup tiolowych [13,14]. Ponadto poziom RFT jest znacznie wyższy u kobiet z tymi zaburzeniami aniżeli w grupie kontrolnej.

W czasie organogenezy w łożysku panują warunki anaerobowe - stężenie tlenu jest bardzo niskie. Dzięki temu wytwarzanie RFT jest ograniczone do minimum, co zapobiega uszkodzeniom DNA zarodka. Badania na zwierzętach potwierdziły, że w początkowej fazie rozwoju zarodek rozwija się znacznie szybciej jeśli utrzymywane jest niskie stężenie tlenu [9]. Anaerobowe warunki zachowane w pierwszym trymestrze ciąży przypuszczalnie wpływają korzystnie na rozwój trofoblastu, umożliwiając  prawidłowe funkcjonowanie integryn, które kontrolują proliferację i migrację komórek. Wyniki badań wskazują, że nieprawidłowy rozwój łożyska oraz degeneracja trofoblastu mogą być wynikiem działania stresu oksydacyjnego zachodzącego w łożysku, co może wywołać  poronienie, stan przedrzucawkowy czy wrodzone  anomalie rozwojowe płodu [15].

Podczas trawienia pokarmów białkowych w organizmie człowieka powstaje homocysteina (w skrócie – tHcy). Przy racjonalnej diecie, zasobnej w niezbędne witaminy, ten aminokwas w niewielkim stężeniu we krwi jest niegroźny dla zdrowia, wręcz potrzebny fizjologicznie, bowiem w cyklu przemian metabolicznych zamienia się w inne aminokwasy niezbędne dla budowy tkanek ciała. Jednak kiedy pewnych witamin zabraknie – przemiana homocysteiny w inne aminokwasy zostaje zahamowana. Wówczas we krwi człowieka pojawia się toksyczny nadmiar homocysteiny. Badania wykazały, że w czasie prawidłowo przebiegającej ciąży stężenie  homocysteiny w osoczu utrzymuje się na niskim poziomie, lecz wiele czynników genetycznych i środowiskowych ma znaczny wpływ na wzrost jej stężenia u kobiet ciężarnych. Uważa się, że homocysteina ma właściwości prooksydacyjne i wzrost jej stężenia może być odpowiedzialny za generowanie stresu oksydacyjnego w organizmie. Zaburzenia metabolizmu homocysteiny mają znaczny wpływ na występowanie poronień samoistnych oraz nawykowych, nieprawidłowości rozwojowych płodu, stanu przedrzucawkowego czy przedwczesnego oddzielania się łożyska. Badania wykazały, że hiperhomocysteinemia  jest jednym  z czynników ryzyka występowania nawracających poronień [16].  

Stres oksydacyjny a zapłodnienie in vitro

Techniki rozrodu wspomaganego medycznie są bardzo ważnym narzędziem w walce z niepłodnością. Mimo badań mających na celu udoskonalenie zapłodnienia metodą in vitro, skuteczność tej metody wciąż  jest niezadowalająca. Do ciąży dochodzi najczęściej w  przypadku około 25-35% zapłodnionych komórek jajowych, przy czym tylko połowa z nich kończy się urodzeniem dziecka. Według Szamatowicza, który w 1987 r.  dokonał pierwszego udanego zabiegu in vitro w Polsce, istotnym czynnikiem warunkującym skuteczność pozaustrojowego zapłodnienia jest wiek kobiety. Po zapłodnieniu metodą in vitro  w ciążę zachodzi średnio 38,7% kobiet poniżej 30. roku życia, 33,1% kobiet w  wieku  31-35 lat i 24,1% kobiet w wieku 36-40 lat, natomiast dla kobiet powyżej 40. roku życia odsetek ten spada do 10,1% [17]. Poznanie czynników wpływających na powodzenie zapłodnienia metodą  in vitro może pomóc w zwiększeniu jej  skuteczności.  Jednym z czynników mających niekorzystny wpływ na zapłodnienie metodą in vitro jest wspominany stres oksydacyjny.

Znaczny wpływ na powodzenie zapłodnienia metodą in vitro może mieć zarówno sposób postępowania w czasie procedury transferu, jak i wiele  czynników pochodzących ze środowiska. Wyniki doświadczeń wykazały, że stężenie tlenu podczas procedury zapładniania nie powinno przekraczać 5% [18]. Wyższe stężenie tlenu powodowało nieprawidłowy rozwój zapłodnionego oocytu myszy. Podwyższone stężenie tlenu może aktywować liczne enzymy systemu oksydaz i  zwiększać ilość generowanych przez nie RFT, natomiast przy niskim stężeniu tlenu (około 5%) komórki są chronione przed działaniem oksydantów, obniża się stężenie H₂O₂ zapobiegając tym samym fragmentacji DNA i nasilonej apoptozie komórek. Badania potwierdziły,  że obniżenie stężenia tlenu wpływa korzystnie na rozwój zarodka myszy oraz na wzrost liczby blastomerów w blastocyście [19]. Wiele danych wskazuje, że przedłużony czas ekspozycji embrionów na światło widzialne  generuje  większe ilości RFT. Światło  może indukować stres fotodynamiczny, odpowiedzialny za oksydacyjne  uszkodzenia nienasyconych kwasów tłuszczowych i cholesterolu błony komórkowej. Badania Goto i wsp. wykazały, że ekspozycja zarodków myszy na światło widzialne trwająca dłużej niż 5 min powoduje znaczny wzrost stężenia powstającego H₂O₂ [20]. W technice zapłodnienia in vitro  wykorzystywane są komercyjne media, które w zależności od składu mogą być źródłem RFT i   znacznie obniżać jakość oocytu i upośledzać rozwój zarodka. Bardzo często dodawane do medium osocze zawiera albuminę, która   pełni rolę chelatora,  ale jest  źródłem oksydazy ksantynowej odpowiedzialnej za generowanie H₂O₂. Dodatek antyoksydantów do środowiska przeprowadzanego zapłodnienia może  korzystnie wpływać na rozwój zarodka i jego jakość. Wyniki badań wykazały, że witamina C, α- tokoferol, genisteina, tauryna czy hipotauryna dodane do medium biorą udział w usuwaniu wolnych rodników i zapobiegają ich oddziaływaniu na proces zapłodnienia [21].

W zapłodnieniu metodą in vitro bardzo istotnym źródłem RFT może być nasienie. Zwiększona ilość RFT często jest wynikiem zanieczyszczenia nasienia leukocytami. Plemniki są bardzo wrażliwe na uszkodzenia oksydacyjne ze względu na małą aktywność enzymów antyoksydacyjnych oraz dużą zawartość wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w cytoplazmie. Uszkodzony przez stres oksydacyjny plemnik (np. ze zdegradowanym DNA)  negatywnie  wpływa na oocyt zarówno w warunkach in vivo, jak in vitro, dlatego też niezbędna jest ocena jakości plemników przed rozpoczęciem inkubacji z oocytem. Uszkodzone i martwe plemniki wytwarzają oksydazę aminową, która reagując ze sperminą bierze udział w tworzeniu H₂O₂. Wyniki badań sugerują, że wydłużony czas inkubacji komórek jajowych z plemnikami (16-20 godzin) znacznie wzmaga stres oksydacyjny, zwiększa liczbę  nieprawidłowych plemników i tym samym niekorzystnie wpływa na zapłodnienie [22]. Nasilony stres oksydacyjny zauważono także podczas krioprezerwacji gamet. Plemniki poddane krioprezerwacji cechuje wyraźne uszkodzenie błony komórkowej, a także znacznie niższe stężenie antyoksydantów oraz większa liczba  uszkodzeń DNA (już po 4 godzinach krioprezerwacji). W komórkach jajowych procedura może powodować silne zaburzenia dojrzewania oocytów oraz nieprawidłowości w cytokinezie [23]. Badania wykazały także, że krioprezerwacja bydlęcych plemników miała znaczny wpływ na obniżenie stężenia antyoksydantów, glutationu (o 78%) i aktywności SOD (o 50%) [24].

W ostatnich latach, stres oksydacyjny stał się powszechnie uwzględnianym czynnikiem w wyjaśnianiu patomechanizmu wielu  chorób. W badaniach nad niepłodnością często opisywane są przypadki tzw. niepłodności idiopatycznej, w których nie można w sposób jednoznaczny wskazać przyczyny niepowodzenia w rozrodzie. Już pół wieku temu sygnalizowano, że nadmierne wytwarzanie  RFT może być szkodliwe dla funkcjonowania męskich i żeńskich komórek płciowych. Istnienie związku między występowaniem stresu oksydacyjnego a jego udziałem w etiopatologii niepłodności zostało zgodnie potwierdzone przez wielu badaczy. Co istotne, dokładny wpływ stresu oksydacyjnego na powodzenie zapłodnienia metodą in vitro oraz na reprodukcję kobiety wciąż nie jest  wyjaśniony i bez wątpienia wymaga dalszych działań naukowców. Być może badania idące w tym kierunku powinny dotyczyć oznaczania parametrów stresu oksydacyjnego w niepłodności i zapłodnieniu pozaustrojowym, jak i  wpływu antyoksydantów na te procesy.