Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Strategie identyfikacji związków docelowych w biologii chemicznej roślin
Strategie identyfikacji związków docelowych w biologii chemicznej roślin
Genetyka chemiczna jest rozumiana jako badanie małych cząsteczek i ich efektów na systemy biologiczne z następującą kolejno identyfikacją związków docelowych. Ma to za zadanie lepsze zrozumienie procesów biochemicznych, na które wpływ wywierają takie związki.

Genetyka chemiczna to szybko rozwijająca się dziedzina nauki z głęboką historią sięgającą badań farmaceutycznych i odkryć leków. Jednak w biologii roślin, jest jeszcze nauką początkującą, opierającą się głównie na analizie fenotypowej w identyfikacji związków docelowych. W przeciągu lat badań wyewoluowało wiele rodzajów strategii badawczych.

Strategie ustalone

Genetyka klasyczna

W tym podejściu populacja mutantów wzrasta w obecności substancji drobnocząsteczkowych, a następnie bada się ją pod kątem odporności. Wykryte organizmy odporne są następnie badane pod kątem niesionych mutacji gwarantujących tę cechę. Główną wadą tej strategii jest nieodłączna konieczność selekcji uwarunkowana tym, że indukowana mutacja powoduje knock – out lub czyni białko nieaktywnym. Odporność na działanie badanej substancji może zostać zapewniona przez inhibicję wiązania tej cząsteczki przy jednoczesnym zachowaniu jej aktywności. Zatem odporność mutanta wynika albo z kwestii braku wiązania, albo z mutacji uniemożliwiających powstawanie białka docelowego. Jednak ten ostatni scenariusz nie ma zastosowania przy pracy z białkami typu „housekeeping”. Ponadto, nadekspresja docelowej proteiny w wyniku zaburzeń genetycznych  również może zagwarantować niewrażliwość mutanta.

Fenotypowanie

W przeciwieństwie do genetyki klasycznej, fenotypowanie polega zazwyczaj na badaniu przesiewowym małych cząsteczek, zanim przystąpi się do właściwego odczytu procesu biologicznego. Następnie przeprowadzenie dalszych testów zawęża zakres możliwych białek docelowych. Wada takiej metody to konieczność przeprowadzenia odpowiedniego odczytu, dostosowanego do znanych mechanizmów ścieżek sygnałowych i enzymów uczestniczących w metabolizmie pierwotnym i wtórnym. Ponadto wynik takich eksperymentów nie wyłania całościowego obrazu interaktomu, a jedynie jeden związek docelowy, bądź ich rodzinę. Dobrą stronę stanowi jednak ukierunkowanie badań na konkretny czynnik, co czyni procedurę dość prostą.

Strategie in silico

W podejściu zwanym z łaciny „in silico”, czyli przy pomocy komputera, punktem wyjścia są białka docelowe lub wygenerowane szkielety małych molekuł. Poszukiwania informatyczne skupiają się na odnalezieniu specyficznych interaktorów dla interesującego białka, bądź poprawieniu właściwości wiążących istniejącej cząsteczki. Walidacja, etap procedury przeprowadzany in vivo, potwierdza ustalone następstwa. Ciągłe wzbogacanie zasobów baz danych z pewnością ułatwi przyszłe modelowanie zjawisk i, przykładowo, opracowywanie składu nowych herbicydów.

 

Strategie rozwijające się

Activity – Based Protein Profiling (ABPP)

Ten sposób identyfikacji związków docelowych opiera się na użyciu molekuł posiadających tzw. „głowicę bojową” (ang. warhead), która nieodwracalnie wiąże się z resztami w miejscu aktywnym enzymu. Te małe cząsteczki wiążą się poprzez łącznik z cząsteczką funkcjonalną (np. biotyną w celu oczyszczenia opartym na powinowactwie), lub z fluoroforem, celem wizualizacji. Ze względu na fakt, że niekażda mała molekuła ukierunkowana na dane białko zdolna jest do reagowania z nim, strategia ABPP ma zastosowanie tylko w przypadku cząsteczek reagujących. Dalej, jeżeli nie wszystkie z nich są zdolne do tworzenia wiązań kowalencyjnych z białkiem, uzyskany metodą ABPP obraz proteomu będzie dużo prostszy do analizy.

Co ważne, opisywana strategia przypisuje aktywności białkom nie tylko w proteomie wewnętrznym, ale nawet w obrębie pewnej rodziny protein, wyłaniając podklasy białek o oznaczonej aktywności.

Drożdżowy system trójhybrydowy (Y3H)

System Y3H opiera się na domenie wiążącej DNA zwanej LexA sfuzjowanej z reduktazą dihydrofolianu (DHFR), która wiąże się z wysokim powinowactwem z metotreksatem (Mtx). Ligand hybrydowy zaś składa się z Mtx połączonego poprzez łącznik z glikolu polietylenowego (PEG) z małymi cząsteczkami, np. kwasem jasmonowym. Poszukiwane molekuły sfuzjowane są z aktywatorem transkrypcji, GAL4. Jeżeli dla kwasu wybrana molekuła byłaby tą docelową, wówczas związanie się tej pary zaindukowałoby przyłączenie aktywatora do DNA i doszłoby do procesu transkrypcji.

Wśród najważniejszych zalet Y3H należy wymienić możliwość przesiewu oddziaływań cząsteczka –białko in vivo, łatwą identyfikację docelowych protein, a nawet ich konkretnych domen oraz klasyfikację białek w ujęciu ich jako związków docelowych dla określonych drobnych cząsteczek. Jednakże białka niezdolne do translokacji do jądra drożdżowego, np. te transmembranowe, nie mogą zostać zbadane metodą Y3H. Stwarza to potrzebę zmodyfikowania małych molekuł, co stanowi minus takiej strategii.

Technologie oparte na zjawisku powinowactwa

Techniki takie miały mniejszy udział w wykorzystaniu ich w badaniach  w zakresie biologii chemicznej roślin. Generuje się pochodną małej cząsteczki o funkcji selektywnej, związaną poprzez wysięgnik z tagiem (np. biotyną), co pozwala na izolację docelowego związku ze złożonej mieszaniny. Tak odsiane związki poddaje się chromatografii cieczowej oraz spektrometrii masowej. Generalna zasada działania takich technik zbliżona jest do ABPP. Jednak w odróżnieniu od tej metody, technologie oparte na powinowactwie nie wymagają aktywności małej cząsteczki wobec jej celu, a więc można użyć szerokiej gamy molekuł. Ponadto istnieje możliwość uzyskania obrazu interaktomu, a nie tylko jednego konkretnego związku oddziałującego. Jednakże należy odróżnić ten ostatni od tła, a także uwzględnić kontrole, co stanowi dość duże utrudnienie. Oczywistą wadą jest też konieczność wybrania tych małych cząsteczek, których struktura pozwala na otagowanie.

Metoda fagowa

Metoda ta (ang. phage display) pozwala z wykorzystaniem bakteriofagów zbadać oddziaływania białko – białko, białko – peptyd lub białko – DNA. Gen kodujący interesujące białko poddaje się insercji w obrębie genu kodującego białko płaszcza faga, co pozwala na ekspozycję badanego białka na powierzchni wirusa (na zewnątrz) przy jednoczesnej obecności genu (wewnątrz). Ukazuje to relację genotyp – fenotyp. Fagi eksponujące proteiny można poddać następnie screeningowi na inne białka, peptydy czy DNA w celu detekcji interakcji pomiędzy tymi cząsteczkami. Dużą zaletę tej metody stanowi duża amplifikacja sygnału przez infekowane bakterie, dzięki czemu następuje pokrycie całego proteomu, łącznie z białkami występującymi w nikłych ilościach. Mimo to, interakcje wymagające modyfikacji posttranslacyjnych czy peptydów wysoce hydrofobowych określa się jako trudniejsze w badaniu tą technologią. Wszelkie zmiany w procedurze musiałyby uwzględnić prawidłowość procesu składania białka.

Technologie wolne od znaczników i oparte na związku

Przesunięcie denaturacji chemicznej

Inna droga badania interakcji ligandów to pomiar stabilności białka, zależnej od wielu czynników: temperatury, denaturantów, wiązania liganda. Zauważalne podwyższenie stabilności proteiny i poprzez to warunków denaturacji w kontekście temperatury, świadczy o związaniu się cząsteczki białka z ligandem. Zazwyczaj wykonuje się pomiary fluorescencji oraz wykorzystuje technikę skaningowej kalorymetrii różnicowej. Jednak w technice przesunięcia denaturacji chemicznej nie mierzy się temperatury topnienia, lecz wzrost stężenia denaturanta wystarczającego do denaturacji białka w obecności liganda. Chociaż metoda ta wywodzi się z optymalizacji przesunięcia chemicznego, nadaje się do wysokoprzepustowych screeningów w strategii odwrotnej genetyki chemicznej.

Target Identification by Chromatographic Co – Elution (TICC)

Starając się wyeliminować możliwość utarty aktywności biologicznej małych cząsteczek po ich otagowaniu, rozwijano alternatywne strategie. Efekt takich działań to powstanie techniki koeulcji chromatograficznej. Polega ona na oznaczeniu przesunięcia w czasie retencji interesującej małej cząsteczki w złożonej mieszaninie białek w porównaniu do tej samej w czystej postaci podczas niedenaturującej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Przesunięcie takie będzie świadczyć o połączeniu z białkiem docelowym, które to oznacza się w następnych etapach procedury.

Drug Affinity – Responsive Target Stability (DARTS)

DARTS to metoda zapewniająca stabilność docelowego białka po jego związaniu z małą molekułą, co czyni je mniej podatnym na trawienie proteolityczne. Posługując się tą techniką, można potwierdzić pewne interakcje cząsteczka – białko poprzez ocenę cięcia proteolitycznego metodą Western blotting. Możliwe jest również znalezienie nowych oddziaływań poprzez analizę lizatów. Ograniczenie oceny wizualnej żelu to słabsza widoczność białek docelowych występujących w mniejszych ilościach. Do ważnych zalet zarówno DARTS, jak i TICC zalicza się brak użycia znaczników, derywatyzacji oraz użycie oryginalnych, niezmodyfikowanych małych cząsteczek.

 

Podsumowując, wybór strategii identyfikacji związku docelowego uzależniony jest od celu badań i dostępnych źródeł, a w wielu sytuacjach konieczne jest zweryfikowanie wyników eksperymentów poprzez zastosowanie innej techniki. Uważa się, że największy potencjał dla przyszłych projektów badawczych w biologii roślin mają strategie wykorzystujące zjawisko powinowactwa.

Źródła

Dejonghe W. i Russinova E. (2014) Target identification strategies in plant chemical biology. Front. Plant Sci. doi: 10.3389/fpls.2014.00352

Brown T. A. (2013) Genomy. PWN, Warszawa

KOMENTARZE
Newsletter