W większości środowisk występowanie fagów jest dziesięć razy częstsze niż bakterii. Podobnie jak wszystkie wirusy, fagi używają maszynerii replikacyjnej komórek gospodarza w celu namnażania się. – Aby to zrobić, stale rozwijają nowe możliwości. Dlatego bakterie, aby przeżyć, potrzebują bardzo aktywnego systemu immunologicznego - mówi prof. Rotem Sorek z Zakładu Genetyki Molekularnej Instytutu Weizmanna (Rehovot, Izrael)

O sposobie działania zintegrowanego systemu CRISPR/Cas pisaliśmy  na naszym portalu (http://biotechnologia.pl/biotechnologia/doniesienia-naukowe/inwazja-owadow-mutantow-to-mozliwe,15196). Przypomnijmy w skrócie, że w przypadku infekcji komórki bakteryjnej DNA fagowym, białka Cas tną obcy materiał genetyczny na niewielkie fragmenty, które są wbudowywane do genomu gospodarza w określone kasety genowe (CRISPR). W trakcie ataku komórki bakteryjnej przez takiego samego faga, ze zintegrowanych z genomem fragmentów powstają specyficzne cząsteczki RNA, które wiążą się z białkami Cas. Taki nukleoproteinowy kompleks jest wykorzystywany do rozpoznania jego materiału genetycznego, a następnie unicestwienia patogenu w wyniku działania białkowej maszynerii. Mechanizm CRISPR/Cas działa zatem na zasadzie nabytej pamięci immunologicznej.

Zdarzyć się może omyłkowe wykorzystywanie przez mechanizmy obronne fragmentów DNA samej bakterii, co może mieć fatalne skutki dla komórki, analogiczne do znanych nam chorób autoimmunologicznych. Pozostaje zatem pytanie, w jaki sposób działa system CRISPR, aby skoncentrować swoją aktywność jedynie na obcym DNA.

Wyjaśnienia tej zagadki podjęli się prof. Sorek oraz jego student Asaf Levy we współpracy z prof. Udi Qimron i Moran Goren (Uniwersytet w Tel Aviv, Izrael) w badaniach nad bakterią Escherichia coli. Badacze opracowali układ doświadczalny składający się z dwóch plazmidów, czyli kolistych cząsteczek DNA, które w tym przypadku naśladowały działanie wirusów. Plazmidy wprowadzano do komórek bakteryjnych, które zawierały enzymy Cas1 i Cas2 będące częścią maszynerii CRISPR. Enzymy te odpowiedzialne były za „pozyskiwanie” fragmentów obcego DNA. Stwierdzono, że fragmenty plazmidowego DNA były z dużym powodzeniem wprowadzane do genomu gospodarza, natomiast własne DNA bakterii „atakowane” było stosunkowo rzadko.

Przyglądając się bliżej wynikom badacze stwierdzili, że system CRISPR za pomocą białek Cas1 i Cas2 specyficznie rozpoznaje to DNA, które szybko się namnaża. To dość ironiczny wynik, ponieważ taktyką wirusów jest właśnie jak najszybsza replikacja. Sposób ich przetrwania staje się zatem jedną z głównych przyczyn ich unicestwienia. Jak podkreśla prof. Sorek, nie wyjaśnia to do końca mechanizmu rozróżniania przez system CRISPR/Cas obcego od własnego DNA bakterii. Okazuje się natomiast, że włączanie do genomu fragmentów DNA zależne jest od procesu replikacji.

Powstawanie przerw w sekwencji DNA w regionie zablokowanych widełek replikacyjnych sprzyja procesowi wbudowania „nowych” sekwencji. Wyniki badań wskazują, że integracja z genomem fragmentów własnego DNA bakterii jest jednak ograniczona ze względu na obecność tzw. miejsc Chi. Są to licznie powtarzające się w rejonach chromosomów bakteryjnych sekwencje związane z procesem rekombinacji homologicznej, który inicjowany jest przez kompleks enzymatyczny RecBCD. Proces wbudowywania nowych fragmentów dotyczy zatem głównie „obcego” DNA, szczególnie biorąc pod uwagę większą liczbę widełek replikacyjnych w ich obrębie.

– Rozwiązanie zagadki „własny kontra obcy” dla bakteryjnego układu immunologicznego i rozszyfrowanie dokładnego mechanizmu tego kroku w procesie kontrolowanym przez CRISPR daje nam istotny wgląd w niewidzialną konfrontację, która ma miejsce wszędzie, cały czas - mówi prof. Sorek.

Dokładne poznanie molekularnych podstaw działania systemu CRISP/Cas jest niezwykle istotne z uwagi na jego zastosowanie, np. w aspekcie ochrony tzw. dobrych bakterii (produkcja sera lub jogurtów).  Jest nie mniej ważne dla celów klinicznych (modyfikacja ludzkiego genomu).