Roślinne kultury in vitro mogą to być zarówno kultury komórek, tkanek, organów i ich części wyizolowanych z roślin macierzystych prowadzone w warunkach sterylnych. Prowadzone są na syntetycznych pożywkach, w ściśle określonych warunkach, dzięki temu możliwe jest m.in. porównanie efektów doświadczeń różnych zespołów badawczych. Fragment pobrany z rośliny określa się mianem eksplantat.

W roślinnych kulturach in vitro wykorzystuje się zjawisko totipotencji (czyli nieograniczonej zdolności do dzielenia się komórek roślinnych, co pozwala na odtworzenie całego organizmu z dowolnej komórki) oraz kompetencji komórek roślinnych (czyli zdolności do odbioru sygnałów i reagowania na nie za pomocą odpowiednich receptorów np. pod wpływem hormonów roślinnych). Dzięki temu możliwe jest ukierunkowanie pobranych komórek na rozwój w określonym kierunku. Najlepiej jest pobierać komórki niezróżnicowane lub słabo zróżnicowane np. merystemy wierzchołkowe, merystemy boczne, nasiona lub zarodki zygotyczne. Nie najlepszym wyborem są komórki szparkowe, komórki wydzielnicze czy komórki przewodzące, gdyż są one fizjologicznie wyspecjalizowane i trudniej reagują na sygnały z zewnątrz.

Rozmnażanie roślin in vitro może odbywać się przez:

• Morfogenezę bezośrednią – czyli bezpośrednie formowanie i rozwój poszczególnych organów roślinnych w warunkach realizacji natywnych (normalnych) programów komórkowych:
• Morfogenezę pośrednią – czyli tworzenie organów roślinnych de novo. Mówi się kaulogenezie (powstawanie pędów przybyszowych), ryzogenezie ( powstawanie korzeni przybyszowych) i embriogenezie somatycznej (tworzenie zarodków bez zapłodnienia);
  • Organogeneza przybyszowa bezpośrednia:
    • Eksplantat (komórka/komórki kompetentne) -> organ
  • Organogeneza przybyszowa pośrednia
    • Eksplantat -> kalus (komórka komórki o indukowanej kompetencji) -> organ
  • Embriogeneza somatyczna bezpośrednia
    • Eksplantat (zawiera PEDCs) -> zarodek

PEDCs – preembriogeniczne zdeterminowane komórki

• • Embriogeneza somatyczna pośrednia
    • Eksplantat -> kalus (zawiera IEDCs) -> PEM -> zarodek

IEDCs – indukowane embriogenicznie zdeterminowane komórki

PEM – preembriogeniczna masa komórek

• Wegetatywne rozmnażanie roślin

Typy stosowanych kultur roślinnych in vitro

Kultury kalusa:

Naturalnie kalus jest wytwarzany przez roślinę w miejscu uszkodzenia rośliny. Z tego powodu jest nazywany również tkanką przyranną. W warunkach in vitro może on powstawać z każdego fragmentu rośliny, który został umieszczony na pożywce zawierającej głównie auksyny. Kalus to tkanka niejednorodna pod względem histologicznym, głównie dlatego, że procesy takie jak różnicowanie, odróżnicowanie i powtórne różnicowanie zachodzą jednocześnie. Można wyróżnić w tej strukturze kilka typów komórek :

• Komórki merystematyczne;
• Komórki miękiszowe;
• Komórki olbrzymie;
• Komórki drewna.

Kalus może mieć różną strukturę czy kolor. Na jego cechy wpływa kilka czynników np. eksplantat z jakiego jest tworzony, zastosowane warunki fizyczne, czy też dodatek substancji chemicznych.

Nowe pojęcia:

Habituacja – inaczej zwana alergizacją, jest to zjawisko stopniowego uniezależniania się kalusa od egzogennych auksyn/cytokinin oraz przystosowanie się do wzrostu na pożywce bez lub przy znacznym obniżeniu ich zawartości.

Tumorowacenie – jest to zjawisko stopniowego uniezależnienia się kalusa od substancji wzrostowych w wyniku infekcji bakterią Agrobacterium tumefaciens.

Kultury zawiesin komórkowych

Mianem kultur zawiesin komórkowych określa się populację pojedynczych komórek lub niewielkich agregatów komórkowych intensywnie rosnąca w wytrząsanej pożywce płynnej, charakteryzująca się powtarzalnymi parametrami wzrostu. Ilość materiału wykorzystanego do zapoczątkowania kultury jest ustalana eksperymentalnie i zwykle wynosi 2-5 g świeżej masy kalusa na 30 ml pożywki. Objętość pożywki nie powinna przekraczać 20-25% pojemności naczynia hodowlanego. Czasem stosuje się kondycjonowanie pożywki, główne w momentach, gdy wzrost i podziały komórek nie są zadowalające. Następuje wtedy dodanie do prowadzonej kultury zawiesinowej pożywki płynnej, w której przez kilka dni rosły już komórki innego gatunku (zawiera ona wydzielone przez nie metabolity).

Kultury zawiesin komórkowych mogą być prowadzone w bioreaktorach. Dzięki temu możliwe jest masowe namnażanie wybranych gatunków roślin oraz produkcja metabolitów roślinnych na skalę przemysłową. Często jest to jedyny sposób rozmnażania niektórych roślin dostępnych komercyjnie.

Inne typy kultur:

• Kultury protoplastów;
• Kultury pąków i merystemów wierzchołkowych;
• Kultury pąków bocznych;
• Kultury korzeni;
• Kultury zarodków;
• Kultury mikrospor i pylników;
• Kultury zalążków lub całych zalążni
• Kultury korzeni włośnikowa tych.

Zastosowanie roślinnych kultur in vitro na skalę przemysłową

Mikrorozmnażanie

Mikrorozmnażanie jest to rozmnażanie klonalne komórek, tkanek, organów roślinnych lub ich fragmentów w kulturach in vitro. W tej technice wykorzystuje się zjawisko morfogenezy bezpośredniej (pobudzanie do rozwoju struktur już istniejących) lub morfogenezy pośredniej (tworzenie de novo struktur przybyszowych). Do masowego mikrorozmnażania stosuje się procedurę wg Debergh’a i Maene (1981). Obejmuje ona 5 stadiów:

• Stadium 0 – prekultury , stadium przygotowawcze,
• Stadium 1 – inicjacja i stabilizacja aseptycznej kultury,
• Stadium 2 – namnażanie – rozmnażanie klonalne,
• Stadium 3 – przygotowanie do warunków in vitro,
• Stadium 4 – przeniesienie do warunków in vivo i aklimatyzacja.

Nowe pojęcie:

Biotyzacja in vitro – jest to proces inokulowania bakteriami symbiotycznymi (bakteryzacja) lub wprowadzanie grzybów mikoryzowych (mikoryzacja). (Stadium 3)

Mikrorozmnażanie (głównie poprzez kultury merystemów bocznych oraz fragmentów przybyszowych) stosowane jest do masowej produkcji roślin o znaczeniu ekonomicznym. Największymi producentami roślin in vitro są m.in. Holandia, Francja, Niemcy, Belgia, Włochy, Polska, Japonia, Tajwan, Chiny, USA, Kanada, Australia i Nowa Zelandia. Mikrorozmnażanie wykorzystuje się także w ochronie środowiska m.in. w rozmnażaniu gatunków rzadkich i ginących oraz do zachowania zasobów genowych roślin.

Sztuczne nasiona

Są to zarodki somatyczne lub inne części roślin zdolne do regeneracji umieszczone w osłonce ochronnej, przygotowane do długoterminowego przechowywania do celów komercyjnych. Celem wytwarzania sztucznych nasion jest przechowywanie i masowe namnażanie identycznych roślin. Istnieją dwie technologie ich wytwarzania:

1. Wykorzystanie uwodnionego materiału
2. Wykorzystanie materiału poddanego dehydratacji

Kolejne kroki wytwarzania sztucznych nasion:

Roślina macierzysta -> eksplantat -> indukcja i proliferacja kalusa embriogennego -> namnażanie komórek w zawiesinie embriogennej -> synchronizacja stadiów embriogenezy i hartowanie zarodków somatycznych -> filtrowanie -> suszenie -> ot oczkowanie -> sztuczne nasiona.

Typy sztucznych nasion:

• Odwodnione i otoczkowane –  zarodki somatyczne marchwi zwyczajnej i selera zwyczajnego;
• Odwodnione i nieotoczkowane – sztuczne nasiona m.in. rzepaku, sosny zwyczajnej, jodły;
• Uwodnione i otoczkowane – przechowywanie cennych genotypów roślinnych w bankach genów;
• Uwodnione nieotoczkowane – zarodki somatyczne marchwi zwyczajnej i batata.