Biotechnologia.pl Czy dobrze przypuszczam, że w badaniach przez państwa prowadzonych peroksydacja lipidów okazała się być kluczowym procesem w indukowaniu nowotworów?

Prof. Barbara Tudek: Ostatnio naszym „naukowym oczkiem w głowie” jest proces peroksydacji lipidów, dlatego że większość jego produktów ma ogromne działanie plejotropowe. Zawsze było tak, że uważano iż wolne rodniki działają na DNA. Ale znacznie bardziej na działanie reaktywnych form tlenu narażone są białka. Może zatem dojść do rozregulowania całego metabolizmu komórki, np.: aktywacji różnych czynników transkrypcyjnych takich jak na przykład c-Jun (ang. c-Jun N-terminal kinase), który kieruje komórkę w stronę proliferacji. Dlatego my w swoich badaniach dużą uwagę poświęcamy temu, jak produkty peroksydacji lipidów wpływają na enzymy naprawy DNA. W pracy opublikowanej w 2009 roku udowodniliśmy, że białka z rodziny CSB biorące udział w kierowaniu naprawy DNA na nić transkrybowaną i zapewniające szybki odzew na uszkodzenia DNA są uszkadzane przez jeden z głównych produktów peroksydacji lipidów, 4-hydroksynonenal (HNE). Uszkodzenie matrycy DNA przez HNE w warunkach in vitro hamuje transkrypcję. W komórkach związek ten aktywuje szlak naprawy związany z transkrypcją, ponieważ fosforyluje białka CSB. Jednocześnie jednak HNE hamuje ATPazową aktywność białka CSB i blokuje naprawę nici podlegającej transkrypcji. To powoduje szybką śmierć komórek, a także rearanżację materiału genetycznego. Rzeczywiście pokazaliśmy, że komórki, którym brak białek CSB są nadwrażliwe na HNE i znacznie zwiększa się u nich częstość wymiany chromatyd siostrzanych. Peroksydacja lipidów towarzyszy procesom starzenia. Nasze badania sugerują, że stany zapalne mogą przyspieszać ten proces, m.in. przez modulowanie naprawy DNA.  

Czy produkty peroksydacji lipidów mogą działać również na enzymy, będące składowymi różnych systemów naprawy DNA?

Tak i nawet w dotychczas prowadzonych badaniach wykazaliśmy, że aktywności poszczególnych enzymów szlaku naprawy DNA przez wycinanie zasad, tj. glikozydazy DNA, czy AP endonukleazy, są modulowane w różny sposób przez produkty peroksydacji lipidów. Niektóre glikozydazy mogą być np.: aktywowane, inne hamowane. I tak np.: AP endonukleaza jest aktywowana poprzez działanie 4-hydroksynonenenalu, polimeraza B właściwie nie odczuwa jego wpływu, natomiast bardzo silnie zahamowana jest aktywność ligazy. Model odpowiedzi komórki na działanie 4-hydroksynonenenalu, może być też modelem konsekwencji stanów zapalnych, ponieważ w stanach zapalnych, produktów peroksydacji lipidów jest bardzo dużo.

Czyli wynika z tego, że istnieje bardzo silna zależność: stany zapalne komórki, a mechanizmy naprawy DNA?

Z dostępnych danych literaturowych wiadomo, że istnieje kilka mechanizmów działania stanów zapalnych w komórce. Pierwszym jest rozregulowanie szlaków sygnalizacyjnych, drugi wynika bezpośrednio z uszkodzeń DNA, a trzeci bierze się z uszkodzeń enzymów naprawy DNA, czego efektem jest fragmentacja kwasu deoksyrybonukleinowego. Takie pofragmentowane DNA bardzo szybko kieruje komórkę na drogę apoptozy, a po drugie może powodować powstawanie mutacji. W celu zbadania tych zależności podjęliśmy współpracę z Uniwersytetem Warszawskim. Przeprowadziliśmy cykl doświadczeń, w których wykazaliśmy, że stopień parylacji białek jądrowych, to jest dołączania reszt Poli-ADP-rybozy (PAR) gwałtownie wzrasta, gdy komórki najpierw poddane są działaniu 4-hydroksynonenalu, związku generowanego w dużej ilości podczas stanów zapalnych, a następnie innych czynników mutagennych utleniających i alkilujących. Powstawanie skupisk PAR jest miarą ilości przerw DNA. Są one generowane przez związki mutagenne bezpośrednio, ale także jako intermediaty podczas naprawy DNA. 4-hydroksynonenal zaburza równowagę systemu naprawczego BER (ang. base excision repair). To zwiększa ilość przerw DNA, jeśli komórka jednocześnie jest eksponowana na inny czynnik mutagenny i zwiększa jej wrażliwość na ten czynnik.

Czy badają państwo również inne stany patofizjologiczne komórki związane z procesem peroksydacji lipidów?

Peroksydacja lipidów ma wpływ na starzenie się komórek i organizmów. Teraz badamy wpływ peroksydacji lipoidów na komórki i tkanki myszy które są defektywne w jednym z białek systemu naprawy DNA przez wycinanie nukleotydów NER (ang. nucleotide-excision repair). Interesuje nas kompleks ERCC1/XPF posiadający aktywność endonukleazy, która nacina z jednej strony uszkodzoną nić DNA, po to aby ten kawałek został wycięty i zresyntetyzowany. Myszy pozbawione białka ERCC1 szybciej się starzeją i żyją maksymalnie 5 tygodni. Ponadto mają one bardzo podwyższone markery stresu oksydacyjnego i są u nich widoczne wszystkie oznaki starzenia się, głównie takie, które pojawiają się przeciętnie w drugim roku życia myszy, a u człowieka po 70 latach. U takich myszy obserwowano zatem: osteoporozę, skrzywienie kręgosłupa, zaćmę i cukrzycę. Badając ich tkanki zaobserwowaliśmy, że proces peroksydacji lipidów jest wyższy u tych myszy, szczególnie w wątrobie. Ponadto udowodniliśmy, że system BER jest rozregulowany u tych myszy, szczególnie hamowana jest ligacja, więc teoretycznie możemy spodziewać się tego, że ich DNA będzie w gorszym stanie, niż u takich myszy będących szczepem dzikim. We współpracy z panią profesor Świeżewską z IBB, badamy teraz profil lipidowy takich organizmów. Dodatkowo nasze eksperymenty wykonujemy również in vitro na modelowych komórkach. Pracujemy na komórkach immortalizowanych wirusem SV40, ale mamy też pierwotne fibroblasty embrionalne, które po 7 podziałach umierają i nie sposób odwrócić tego zjawiska.

A co z przeniesieniem państwa badań na pole nauk stosowanych?

Myślę, że nasze badania nad peroksydacją lipidów mogą być pomocne w walce z chorobą nowotworową, dlatego postanowiliśmy przełożyć je również na badania kliniczne. Dzięki współpracy prowadzonej z profesorem Olińskim z Collegium Medicum Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Bydgoszczy, możliwe było otrzymanie próbek pochodzących od pacjentów ze zdiagnozowanym rakiem płuca i rakiem jelita grubego. Grupa profesora Olińskiego badała markery stresu oksydacyjnego, takie jak: 8-oksoguanina, kwas moczowy, czy niskocząsteczkowe antyutleniacze w moczu i w leukocytach krwi obwodowej. My natomiast monitorowaliśmy naprawę uszkodzeń DNA, które powstają bezpośrednio oraz podczas peroksydacji lipidów. Udało nam się opublikować 2 prace w Cancer Research, mówiące o tym, że u chorych na raka płuca obniżony jest poziom naprawy 8-oksoguaniny, a polimorfizm białka wycinającego tę uszkodzoną zasadę DNA może być związany z rozwojem choroby nowotworowej. Wykazaliśmy ponadto, że różne typy histologiczne raka płuca mają zróżnicowaną efektywność naprawy poszczególnych oksydacyjnie zmienionych zasad DNA. Jeśli chodzi o niedrobnokomórowego raka płuc, to rak gruczołowy jest związany z niedoborem systemu naprawy etenoadduktów, które powstają wskutek peroksydacji lipidów, natomiast płaskonabłonkowy rak płuca jest związany z nieefektywną naprawą 8-oksoguaniny. W raku jelita grubego również monitorowaliśmy systemy naprawy oksydacyjnych uszkodzeń DNA i zanotowaliśmy podwyższoną obecność 8-oksoguaniny w moczu i DNA leukocytów pacjentów. Okazało się również, że poziom kwasu moczowego i 8-oksoguaniny w leukocytach i w moczu są bardzo dobrym markerem predykcyjnym przeżycia chorych. Ci, którzy mają wysokie stężenie kwasu moczowego i niskie stężenie 8-oksoguaniny mają szansę na długie życie. Zastanawiamy się też, czy te czynniki mogą stać się zestawem markerów predykcyjnych. Pewnym jest natomiast, że czynnik braku naprawy oksydacyjnych uszkodzeń DNA nie jest przypisany dla konkretnej jednostki chorobowej, ale może przyczynić się do rozwoju wielu chorób, które powstają na tle stresu oksydacyjnego, czyli np.: neurodegeneracji, chorób serca, arteriosklerozy i oczywiście nowotworów.

Czy może Pani powiedzieć co państwo planują na przyszłość?

Obecnie zaczynamy projekt, w którym poszukujemy markerów wrażliwości na terapię fotodynamiczną. Takich badań jest sporo na modelu komórkowym, który zresztą również będziemy stosować, ale mało na materiale klinicznym. Naszą uwagę skupiamy na naprawie DNA. Takich danych w literaturze jest bardzo mało, więc nasze badania są jak najbardziej pionierskie.

Życzymy sukcesów i powodzenia w dalszej pracy. Dziękujemy za rozmowę.

Wywiad przeprowadziła dr Marzena Szwed, redaktor naukowy portalu Biotechnologia.pl