Biotechnologia.pl: Czy można w jakikolwiek sposób zaobserwować zmianę aktywności komórek nerwowych mózgu pod wpływem uczenia się na modelach zwierzęcych?

 Dr Anna Posłuszny: Można. W naszych badaniach uczenie zwierząt polega na zestawianiu dwóch bodźców w czasie, jeden bezpośrednio po drugim. Oba bodźce muszą być dla zwierzęcia czytelne. Jeden z nich, bodziec bezwarunkowy, musi mieć dla zwierzęcia znaczenie biologiczne. Znaczenie bodźca może być pozytywne lub negatywne. Na przykład, bodźcem może być pokarm, choćby w postaci podawanej na język posłodzonej wody, ale może nim być też drażnienie elektryczne. Bodziec bezwarunkowy poprzedzony jest bodźcem warunkowym, który jest dla zwierzęcia czytelny, ale nie ma już takiego znaczenia biologicznego, może to być na przykład zapalenie się lampki albo konkretny dźwięk. Taka para bodźców jest wielokrotnie powtarzana, dzięki temu zwierzę zaczyna kojarzyć, występowanie obu bodźców ze sobą. Zapamiętuje, że po pierwszym bodźcu następuje drugi i zaczyna utożsamiać pierwszy bodziec z drugim. Na tym polega warunkowanie klasyczne, jedna z form uczenia asocjacyjnego. Nasz model uczenia, polega na stymulowaniu wybranego rzędu wibryss czuciowych na pyszczku myszy, czyli ich głaskaniu cienkim pędzelkiem, zestawionego z bodźcem bezwarunkowym, czyli sygnałem podawanym na ogon myszy. Ten drugi bodziec to rodzaj mrowienia, nie jest to bodziec bólowy, ale jest nieprzyjemny.

Dlaczego wykorzystują państwo wibryssy jako „bezpośrednie czujniki”, które odbierają stymulację?

Wibryssy na pyszczku gryzoni są świetnym modelem do badania, w jaki sposób przetwarzana jest informacja sensoryczna. Schemat ułożenia wibryss na pysku zwierzęcia jest odzwierciedlony w korze mózgowej przez analogiczny schemat rozmieszczenia struktur odbierających informację od poszczególnych wibryss. Te struktury łatwo można zobaczyć w preparatach histologicznych. Dlatego, jeśli wybieramy określoną wibryssę lub rządwibryss do stymulacji podczas uczenia dokładnie wiemy, a właściwie widzimy, w którym miejscu kory mózgowej należy spodziewać się wywołanych uczeniem zmian.

Co jest bezpośrednim parametrem przez państwa mierzonym?

Monitorujemy plastyczność kory mózgowej pod wpływem uczenia się – inaczej mówiąc badamy zmiany jakie w korze mózgowej wywołuje uczenie. Jedną ze zmian indukowyanych w korze mózgowej w wyniku uczenia jest zwiększenie obszaru reprezentacji wibryss, które wykorzystywane były w uczeniu, tzn. więcej komórek w korze mózgowej aktywuje się w odpowiedzi na sygnały z tych wibryss lub jeśli wcześniej część komórek reagowało w mniejszym stopniu, teraz reaguje mocniej. Zmianę tę obserwujemy dzień po zakończeniu treningu uczenia. Rzecz stała się jeszcze ciekawsza w momencie, kiedy okazało się, że temu zwiększeniu reprezentacji wibryss towarzyszy wzrost różnych parametrów związanych z transmisją hamującą w tym obszarze: zwiększa się ilość wydzielanego transmitera hamującego, zwiększa się liczba synaps hamujących i zwiększa się synteza enzymu, który odpowiada za produkcję neurotransmitera hamującego. Te badania wykonane zostały zanim jeszcze pojawiłam się w Pracowni Neurobiologii Instytutu Nenckiego.

Wydaje się to paradoksalne, że z jednej strony więcej komórek w korze mózgowej aktywuje się w odpowiedzi na stymulację wibryss, a jednocześnie zwiększa się poziom transmisji hamującej. Jak to tłumaczyć?

Ten paradoks jest pozorny.  W mózgu mamy dwie główne grupy komórek nerwowych. Są tam komórki projekcyjne, które mają długie wypustki - aksony, które wychodzą poza tę strukturę, w której zlokalizowane są ich ciała komórkowe. Po drugie są tam również interneurony. Interneurony występują lokalnie w danej strukturze lub warstwie i komunikują się z lokalnie występującymi komórkami projekcyjnymi. Miażdżącą większość pośród interneuronów, stanowią interneurony hamujące, które uwalniają neurotransmiter hamujący. Główną masę kory mózgowej i hipokampa stanowią pobudzające komórki projekcyjne, podczas gdy interneurony hamujące to około 10% wszystkich komórek nerwowych. A jednak, jeden taki interneuron jest w stanie unerwiać dużą liczbę (nawet 300) komórek projekcyjnych, jednocześnie sam odbierając informacje od wielu komórek projekcyjnych. Okazuje się więc, że interneurony, których jest tak mało, mają jednak przemożny wpływ na to, co się dzieje z komórkami projekcyjnymi i tak naprawdę to one komórkami projekcyjnymi sterują. Z badań elektrofizjologicznych wiadomo, że interneurony hamujące nadają aktywności komórek projekcyjnych porządek czasowy i wykrywają sygnały koherentne. Stąd wynika kluczowa rola interneuronów hamujących w uczeniu.

Czy mogę zatem podejrzewać, że bezpośrednim celem projektu, w którym Pani teraz uczestniczy jest zbadanie, co się dzieje z interneuronami w trakcie zmian w korze mózgowej pod wpływem uczenia?

Tak. Interneurony to niezwykle ciekawa grupa komórek. Podczas gdy, komórki projekcyjne stanowią dość jednorodną grupę pod względem funkcjonowania, interneurony są bardzo zróżnicowane. Istnieje wiele grup interneuronów. Określone grupy interneuronów wysyłają sygnały do różnych przedziałów w komórce projekcyjnej, co okazuje się mieć niebagatelne znaczenie. Jedna grupa interneuronów unerwia początkowy odcinek aksonu komórki projekcyjnej, inna grupa interneuronów unerwia dendryty (np. w takim miejscu, gdzie te dendryty mają połączenie z jakimiś innymi strukturami), jeszcze inne interneurony będą miały połączenia z ciałem komórki. Poszczególne przedziały połączeń między interneuronami a komórkami projekcyjnymi mają odmienny wpływ na pracę komórki projekcyjnej. Inne znaczenie ma unerwianie początkowego odcinka aksonu (tu następuje modyfikacja sygnału wysyłanego z komórki), a inne znaczenie ma unerwienie dendrytów (miejsc w których komórka dopiero odbiera informacje). Poszczególne grupy interneuronów różnią się wzorcami aktywności elektrycznej. I to one odpowiadają za generowanie oscylacji, które można obserwować w encefalogramie (EEG), rytmu theta, rytmu gamma, bądź szybkich fal, które jak wiadomo związane są z procesami przetwarzania informacji i tworzeniem śladów pamięciowych. Projekt, w którym teraz uczestniczę, i który jest już na bardzo zaawansowanym etapie polega m.in. na zdefiniowaniu, występujących specyficznie w poszczególnych grupach interneuronów, markerów, które mogą mieć znaczenie dla obserwowanych przez nas zmian plastycznych w korze mózgowej. Po drugie chcieliśmy się dowiedzieć, czy zwiększenie transmisji hamującej jest potrzebne do tego, żeby zaszła tam zmiana plastyczna, czy może transmisja hamująca jest wynikiem tej zmiany.

W jaki sposób prowadzone są te badania?

Zastosowaliśmy metodę podwójnego barwienia. Mianowicie, wykrywamy enzym odpowiedzialny za produkcję neuroprzekaźnika hamującego, czyli dekarboksylazy kwasu glutaminianowego (GAD, ang. glutamic acid decarboxylase) - wszystkie interneurony hamujące produkują GAD, jednocześnie wykrywamy białka-markery charakterystyczne dla poszczególnych grup interneuronów np. somatostatynę, parwalbuminę czy kalbindynę. Wcześniej uzyskane dane pokazały, że nie zwiększa się również produkcja parwalbuminy. Z obecnie przeprowadzonych badań wynika, że obserwowanej przez nas plastyczności kory mózgowej towarzyszy wzrost produkcji somatostatyny, podczas gdy poziom kalbindyny i kalretyniny nie zwiększa się. Somatostatyna wykazuje w mózgu zupełnie inne działanie niż inne badane białka. Parwalbumina, kalbindyna i kalretynina mają znaczenie w modulowaniu sygnałów wapniowych wewnątrz komórki. Natomiast somatostatyna jest neuromodulatorem. Uwalniana z komórki na zewnątrz hamuje sąsiadujące komórki. Wydaje się, że takie działanie somatostatyny ma znaczenie dla kształtowania zmian plastycznych i jest ważne w kontekście danych dostarczonych przez labolatorium z Kaliforni (Gdalyahu i wsp., 2012). Dane te zostały uzyskane na podobnym modelu uczenia, lecz z przedłużeniem czasu obserwacji zmian plastycznych w korze mózgowej. Uzyskane wyniki wskazują, że plastyczność jest procesem dynamicznym. Najpierw pod wpływem uczenia następuje zwiększenie aktywności danego obszaru w korze mózgowej, a następnie zmniejszenie. W rezultacie tych procesów z puli aktywowanych w pierwszej fazie plastyczności komórek nerwowych wybierane są te, które najefektywniej reagują na bodziec, tzn. reagują w bardzo specyficznie i z największą siłą. Wyniki naszych badań opublikowaliśmy już w czasopiśmie Neuroscience.

Na czym polega drugi etap projektu?

Chcieliśmy odpowiedzieć na pytanie, czy zwiększenie transmisji hamującej jest potrzebne do tego, żeby zaszła tam zmiana plastyczna, czy może transmisja hamująca jest wynikiem tej zmiany. Badania polegały na krótkotrwałym zmniejszeniu transmisji hamującej w momencie kiedy zwierzę się uczy i sprawdzeniu, czy nastąpi zmiana plastyczna mózgu, czy też nie nastąpi. W tym celu przed każdym treningiem wstrzykiwałam myszom (do kory mózgowej) antagonistę receptorów dla transmisji hamującej, konkretnie receptorów GABA_A (receptory przyłączające kwas gamma aminomasłowy – neurotransmiter hamujący). Okazało się, że po zmniejszeniu transmisji hamującej nie następowało zwiększanie reprezentacji wibryss stymulowanych w trakcie uczenia. Oznacza to, że transmisja hamująca jest potrzebna do tego, żeby zaszła zmiana plastyczna w mózgu. Wydaje się, że samo pobudzenie komórek nerwowych bez jego odpowiedniego uporządkowania przez aktywność interneuronów nie uzyskuje znaczenia, przez to, że nie jest czytelne, traci na znaczeniu i nie zostaje zapisane w korze mózgowej.

Jakie są Pani przyszłe plany badawcze?

Rozpoczynam nowy projekt, który dotyczy udziału synaps elektrycznych. Synapsy elektryczne zapewniają bezpośrednią komunikację interneuronów hamujących należących do tej samej grupy. Z tego względu mają znaczenie dla aktywności interneuronów i ich funkcji kontrolowania pobudzających komórek projekcyjnych. Chcemy zbadać, jak duży wpływ mają synapsy elektryczne na powstawanie zmian plastycznych w korze mózgowej. Otrzymaliśmy finansowanie tych badań z Narodowego Centrum Nauki. W ramach projektu zostanie zakupiony system do prowadzenia optycznego obrazowania sygnałów wewnętrznych. Za pomocą bardzo czułej kamery będę rejestrować aktywność komórek kory mózgowej u tego samego zwierzęcia przed i po treningu uczenia się.

Życzymy dalszych sukcesów i powodzenia w przyszłych przedsięwzięciach.

Wywiad przeprowadziła dr Marzena Szwed, redaktor naukowy portalu Biotechnologia.pl

Materiał opracowała: mgr Ewelina Gizińska