Początkowo, w latach 70 P. pastoris znalazła zastosowanie w przemyśle do produkcji białka paszowego jednokomórkowców (single-cell protein), dzięki możliwości wygenerowania dużej gęstości komórek w bioreaktorze (ponad 130g suchej masy na litr) oraz niskiej ceny metanu, z którego produkowano metanol. Jednakże, kryzys olejowy i jednoczesny spadek cen soi, głównego alternatywnego źródła paszy zwierzęcej w tych czasach, spowodowały nieopłacalność całej operacji i zaprzestanie jej. Dopiero w latach 80 ponownie zainteresowano się tym mikroorganizmem izolując z niego gen i promotor oksydazy alkoholowej i tworząc na ich podstawie wektory i zmodyfikowane odmiany Pichii.
Zalety P. pastoris jako systemu ekspresji białek heterologicznych
P. pastoris stała się tak popularnym systemem ekspresji białek heterologicznych głównie dzięki połączeniu wszystkich zalet pochodzących z wyższych systemów eukariotycznych jak modyfikacje posttranslacyjne czy odpowiednie sfałdowanie białka, z prostymi i dobrze znanymi metodami manipulacji genetycznej jak u Saccharomyces cerevisiae oraz efektywnymi i ściśle regulowanym promotorom. Te promotory, oparte na genie oksydazy alkoholowej , pozwalają na osiągniecie wysokiego poziomu ekspresji białek heterologicznych (w niektórych przypadkach wyższego 10-100 krotnie niż u E.coli czy S.cerevisiae). W połączeniu z efektywnym mechanizmem ekspresji i możliwością wprowadzenia sygnałów ekspresji pozakomórkowej (np. α-MF z S.cerevisiae) znacznie zmniejsza koszty odzyskiwania i oczyszczania białka. Ponadto, system ekspresji u P.pastoris ma mniejszą tendencje glikozylacji białek, niż u S.cerevisiae (najnowsze szczepy są wstanie osiągnąć
N-glikozyacje białek prawie identyczną do ludzkiej) co jest ważną cechą przy produkcji białek wykorzystywanych w terapiach u ludzi.
Metabolizm metanolu
Przyczyną wykorzystania P. pastoris jako platformy do ekspresji białek było zauważenie faktu, że niektóre enzymy zaangażowane w metabolizm metanolu są obecne w znaczących ilościach tylko gdy metanol jest jedynym źródłem węgla. Jednym z tych enzymów jest oksydaza alkoholowa (AOX), która katalizuje oksydacje metanolu do formaldehydu. Ten pierwszy krok szlaku metabolizmu metanolu odbywa się w specjalnym organellum – peroksysomie, gdzie występują enzymy uczestniczące w procesie neutralizacji szkodliwego nadtlenku wodoru – katalazy. Część formaldehydu opuszcza peroksysom i jest dalej poddawana oksydacji do kwasu mrówkowego i CO2 generując energię dla komórki rosnącej wyłącznie na metanolu. Pozostały formaldehyd jest przekształcany do aldehydu 3-fosfoglicerynowy (GAP) wykorzystywanego do innych szlaków metabolicznych poprzez szlak cykliczny rozpoczynający się kondensacją formaldehydu z ksylulozo-5-fosforanem (Xu5P). Reakcja ta katalizowana jest przez trzeci enzym peroksymowy - syntazę dihydroksyacetonową (DHAS). Produkty tej reakcji , GAP i dihydroksyaceton (DHA) opuszczają peroksysom i włączają się w szlak cytoplazmatyczny, w którym regenerowana jest cząsteczka ksylulozo-5-fosforanowa, a co trzeci cykl generuje cząsteczkę aldehydu 3-fosfoglicerynowego.
Rysunek 1 Schemat metabolizmu metanolu w P.pastoris 1- oksydaza alkoholowa, 2- katalaza, 3- dehydrogenaza formaldehydowa, 4- dehydrogenaza kwasu mrówkowego, 5- syntaza dihdroksyacetonu, 6- kinaza dihydroksyacetonu, 7- aldolaza fruktozo-1 6-bisfosforanu, 8- 1,6-bifosfataza fruktozy
Promotor AOX
Ekspresja genu oksydazy alkoholowej regulowana jest na poziomie transkrypcji. W kulturze rosnącej na metanolu jako jedynym źródle węgla około 5% poly(A)+ RNA pochodzi z genu AOX1, podczas gdy na innych źródłach węgla (np. glukozie czy glicerolu) gen oksydazy alkoholowej jest praktycznie nie ekspresjonowany. Regulacja ekspresji genu AOX1 jest dwupoziomowym procesem represji /derepresji i mechanizmu indukcji podobnie jak w przypadku GAL1 S.cerevisiae. Jednakże, wzrost na pożywce z represorem transkrypcji (np. glukozą) powoduje brak transkrypcji nawet w obecności induktora –metanolu. Dlatego też przy kultywacji P.pastoris w fazie wzrostu stosuje się podłoża o minimalnym, koniecznym do wzrostu stężeniu glicerolu, a następnie przestawia się kultury na indukcje metanolem w fazie stacjonarnej.
Wektory oparte na promotorze AOX1 są opatentowane i sprzedawane na licencję, jednakże wykorzystywanie ich w celach badawczych jest zwolnione z opłat. Typowe wektory maja strukturę zaprezentowaną poniżej.
Rysunek 2 Schemat typowego wektora opartego na genie oksydazy alkoholowej
Składają się z 5’AOX1 promotora, miejsca na sygnał ekspresji pozakomórkowej, który poprzedza fragment polilinkera, z miejscami restrykcyjnymi umożliwiającymi wprowadzenie własnego genu. Dalej znajduje się terminator transkrypcji zapewniający efektywne poliadenylację nowopowstałego mRNA, marker dla P.pastoris oraz 3’AOX1, które wraz z 5’AOX1 umożliwiają integracje wektora w genom P.pastoris. Ponieważ są to wektory wahadłowe (ang. shuttle vector) umożliwiające replikacje zarówno w E.coli celem wprowadzenia własnego genu w plazmid, jak i P.pastoris dla zwiększenia liczby kopii i ekspresji danego genu. Zapewnia to umieszczenie bakteryjnego sygnału początku replikacji ori oraz markera dla E.coli (np. genu rezystancji na ampycylinę), oraz markera dla P.pastoris (np. ADE1, ARG4, G418, HIS4, URA3) umożliwiających selekcję pozytywnych transformantów na odpowiednim podłożu.
Alternatywne promotory ekspresji
Kolejną opcją ekspresji w P.pastoris jest wykorzystanie promotora genu dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerolowego (PGAP) zapewniającego konstytutywną ekspresję (na tym samym poziomie, nie indukowaną) na podłożu z glukozą o porównywalnej do promotora AOX1 ekspresji. Zaletą tego rozwiązania jest brak konieczności zmiany źródła węgla, jak w przypadku promotora AOX1, jednakże nie jest to dobry wybór dla ekspresji białek toksycznych dla tych drożdży.
Pichia jako producent farmaceutyków
Istnieje ponad 300 protokołów ekspresji efektywnej ekspresji białek w Pichii pastoris, z czego ponad 150 dotyczy białek ludzkich. Przykładem może być IGF-1 wykorzystywane przy leczeniu stwardnienia zanikowego bocznego, czy ludzkiej albuminy – zamiennika osocza.
Jacek Plewka
Źródła:
http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/pich_man.pdf
http://www.rctech.com/licensing/gxt-pichia.php
FEMS Microbiology Reviews 24 (2000) 45-66; Joan Lin Cereghino, James M. Cregg: Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris
J Mol Recognit.2005 Mar-Apr;18(2):119-38. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production.
KOMENTARZE