Istnieje szereg danych świadczących o obfitym uwalnianiu komórek nowotworowych z guza pierwotnego i krążeniu ich w krwioobiegu. Już w 1868 roku Thomas Ashworth obserwował krążące komórki nowotworowe w krwi mężczyzny z przerzutami nowotworowymi [1]. Porównanie morfologii krążących komórek z komórkami guza pozwoliło Ashworthowi stwierdzić, że jeżeli CTCs pochodzą z guza to muszą przechodzić przez większą część układu krążenia. Izolacja rzadkich, krążących komórek nowotworowych z krwi pacjentów chorych na raka cieszy się ostatnio rosnącym zainteresowaniem badaczy i  klinicystów. CTCs to komórki, które odczepiły się od guza pierwotnego, przeniknęły do krwiobiegu i krążą w bardzo małych ilościach, z częstością jednej CTC na 106-107 jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC). Obecność komórek CTCs u pacjentów chorych na raka może świadczyć o agresywnym przebiegu pierwotnego nowotworu lub obecności mikroprzerzutów [2]. Analiza ilościowa i jakościowa komórek CTCs może dostarczyć informacji prognostycznych, pozwala monitorować odpowiedź na zastosowane leczenie oraz poznać biologię komórek nowotworowych odpowiedzialnych za tworzenie przerzutów. Co istotne, monitorowanie liczby CTCs przed, w trakcie i po leczeniu może stanowić niezależny czynnik wskazujący na skuteczność terapii. Rosnący guz uwalnia od ok. 100 do 300 komórek nowotworowych w ciągu dnia (w przeliczeniu na 1 gram tkanki nowotworowej). Tak, więc ocena liczby tych komórek we krwi obwodowej jest niezwykle przydatna zarówno w wykrywaniu różnego rodzaju nowotworów, jak również w trakcie oceny  przebiegu leczenia [3].

Komórki nowotworowe przedostają się do krążenia poprzez istniejące już naczynia lub przez nowo powstałe kapilary guza. W procesie nazywanym „przejściem epitelialno-mezenchymalnym” (EMT – epithelial-mesenchymal transition), fenotyp komórek nowotworowych zmienia się, co ułatwia „ucieczkę” komórek z tkanki guza i przekształcenie ich w komórki inwazyjne [4]. Liczne modyfikacje białek i zmiany na poziomie ich transkrypcji, powodują, że CTCs tracą polaryzację typową dla komórek nabłonkowych oraz zdolność przylegania, zyskując tym samym - nową morfologię, ułatwiającą ich przemieszczanie. Kluczowym  etapem tego procesu jest częściowa lub całkowita utrata ekspresji E-kadheryny oraz innych swoistych markerów komórek nabłonkowych różnych metaloproteinaz oraz ciągłym współdziałaniem z powierzchnią śródbłonka [5]. Nabycie przez komórki nowotworowe cech charakterystycznych dla komórek mezenchymalnych daje im możliwość migracji z naczynia krwionośnego do środowiska nowej tkanki. Naciekanie przestrzeni okołonaczyniowych jest niekorzystnym czynnikiem prognostycznym wyleczenia chorych. Zdolność CTCs do rozrostu w guz jest jednak ograniczona, ponieważ wraz ze zmianą lokalizacji zmienia się ich mikrośrodowisko [6].  Cały proces w dalszym ciągu stanowi jednak ogromną zagadkę dla naukowców ponieważ nie wiadomo, dlaczego część CTCs jest zdolna zasiedlać i rozwijać się w guz w pewnych narządach, a w innych zaś, podobny proces nie zachodzi. Do tej pory nie jest jasne także jakie warunki  powinno spełniać mikrośrodowisko, aby doszło do nowotworowej proliferacji komórek. Wykrywanie CTCs, a właściwie ich rozpoznawanie spośród innych komórek obecnych w krwi jest przedmiotem licznych i długotrwałych badań, a w ciągu ostatnich lat opracowano  wiele metod izolacji i detekcji CTC. Oto wybrane z nich:

Metody izolacji w oparciu o właściwości fizyko-chemiczne

Kluczowymi elementami, które pozwalają odróżnić krążące komórki nowotworowe od komórek krwiotwórczych i prawidłowych komórek są ich fizyczne i biologiczne właściwości, takie jak: wielkość, gęstość i ekspresja specyficznych białek. Metoda izolacji nabłonkowych komórek nowotworowych na podstawie ich wielkości (ISET – isolation by size of epithelial tumor cells) pozwala na izolację komórek CTCs jednak nie większych niż 8 μm. Niedoskonałością tej metody jest jednak fakt, że przeprowadzone do tej pory badania nie potwierdziły hipotezy, iż wszystkie komórki CTCs są większe niż 8 μm [7]. Dane naukowe wskazują,  że komórki guza mają mniejszą gęstość niż inne, prawidłowe komórki w krążeniu, dlatego też istnieją komercyjnie dostępne metody bazujące na izolacji komórek poprzez ich wirowanie w gradiencie stężenia (z wykorzystaniem odczynników takich jak Ficoll-Hypaque czy Lymphoprep) [8].

Izolacja immunomagnetyczna

Dzięki tej metodzie możliwe jest zidentyfikowanie i „wyłapanie” komórek CTCs z krążenia dzięki specyficznym markerom powierzchniowym. Najpowszechniej stosowanymi systemami izolacji immunomagnetycznej są zestawy MACS Systems (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy) czy RARE (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Kanada). Niektóre z tych metod opierają się na negatywnej selekcji jednojądrowych komórek z użyciem przeciwciała anty-CD45, inne wykorzystują pozytywną selekcję opartą na identyfikacji nabłonkowych markerów komórek guza przez przeciwciała monoklonalne [9,10]. Selekcja pozytywna, która jest najczęściej stosowaną metodą,  opiera się na ocenie antygenu adhezyjnego komórek nabłonkowych (ang. epithelial cell adhesion molecule-EpCAM). Co istotne, antygen ten nie występuje fizjologicznie na nienowotworowych komórkach obecnych we krwi. Do oznaczania CTCs używa się testu CellSearch Circulating Tumor Cells Test (Varidex LLC, San Diego, CA), który jako pierwszy został dopuszczony do użycia przez FDA [11]. Wykrywanie CTCs przy zastosowaniu EpCAM jest efektywne, jednak zauważono, że jego ilość na powierzchni CTCs spada w procesie odróżnicowywania się komórek nabłonkowych, co często ma miejsce przy rozpoczęciu procesu migracji komórek nowotworowych. Metoda jest jednak stosowana i wykorzystując tę technikę wykazano kliniczną wartość oznaczeń CTCs w raku piersi, raku jelita grubego i raku prostaty. U chorych z tymi nowotworami, zależnie od obecności CTCs różnił się czas przeżycia [12].

Metody kombinowane

Wyniki licznych doświadczeń poświęconych zwiększeniu możliwości a przede wszystkim efektywności izolacji CTCs za pomocą metod wykorzystujących EpCAM, są w dalszym ciągu nieliczne. Problem stanowi stosunkowo  niewielka liczby krążących komórek nowotworowych, co powoduje, że trudno je „złapać” w odpowiedniej ilości. W związku z tym kolejnym krokiem w izolacji tych komórek było opracowanie metod kombinowanych. Jedna z nowszych technologii molekularnych AdnaTest (AdnaGen AG, Niemcy) łączy immunomagnetyczną selekcję komórek MUC1/HER2/EpCAM+ z identyfikacją genetyczną komórek CTCs za pomocą panelu trójgenowego i RT-PCR (RT-PCR – Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction). Wyselekcjonowane komórki CTCs poddawane są następnie lizie w celu izolacji mRNA, które jest następnie analizowane pod względem markera HER2 (receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu) i powierzchniowych glikoprotein MUC1 i GA733-2 za pomocą ilościowego RTqPCR. Niestety, jak w przypadku większości stosowanych metod, również w stosowaniu tej istnieją pewne ograniczenia, ponieważ ekspresja HER2 występuje również na aktywowanych limfocytach T [13]. Kolejną metodą detekcji komórek CTC jest test EPISPOT (ang. EPithelial ImmunoSPOT), który po wyeliminowaniu komórek CD45+, identyfikuje tylko żywe komórki. W technice tej identyfikikacja komórek CTCs opiera się na podstawie wydzielanych lub uwalnianych przez nie białek w ciągu 48-godzinnej hodowli in vitro. Ograniczeniem testu EPISPOT jest jednak trudność w uzyskaniu dużej liczby komórek oraz ich hodowla in vitro [14]. Zdecydowanie godną uwagi jest metoda izolacji CTCs na  platformie mikroprzepływowej CTC-chip opracowana w Massachusetts General Hospital Center for Engineering in Medicine. Głównym założeniem tego systemu jest przepływ krwi przez płytkę z mikrosłupkami pokrytymi przeciwciałami anty-EpCAM. Płytka z komórkami nowotworowymi jest następnie wybarwiana i analizowana z pomocą mikroskopu fluorescencyjnego [15]. Znaczącą wadą tej metody jest jednak to, że nie jest dostępna komercyjnie.

Identyfikacja i monitorowanie krążących komórek nowotworowych we krwi obwodowej pacjentów rzuca nowe światło na nieinwazyjną  diagnostykę chorób nowotworowych. Rozwój nowych technik identyfikacji CTCs stwarza szansę odróżnienia stadium choroby ograniczonej do narządu (którą można wyleczyć chirurgicznie) od choroby rozsianej (którą można leczyć metodami systemowymi). Kluczowym elementem wydaje się śledzenie wędrówki komórek CTCs, kontrolując tym samym rozsiew choroby nowotworowej. Dodatkowo profilowanie genetyczne CTCs być może pozwoli w przyszłości na indywidualny dobór terapii dla pacjenta.