Chromatografia jest jedną z technik analitycznych i preparatywnych, dzięki której dokonywany jest rozdział mieszanin różnych związków chemicznych. Rozdział ten następuje w wyniku przepuszczania badanego roztworu przez specjalnie przygotowane złoże (tzw. fazę stacjonarną). Ponadto w układzie istnieje również faza rozdzielcza, która charakteryzuje się zdolnościami sorpcyjnymi lub też innymi właściwościami w stosunku do substancji przepływającej. Podczas przepływu eluantu (faza ruchoma) przez fazę rozdzielczą następuje proces wymywania zaadsorbowanych (lub związanych) substancji. Intensywność tego wymywania jest różna dla poszczególnych składników mieszaniny, dlatego też jedne substancje zatrzymywane są dłużej, a inne krócej, co pozwala na separację tych związków z badanej mieszaniny.
W zależności od parametrów prowadzenia procesu możemy wyróżnić m.in. następujące typy chromatografii:
- wysokosprawną/wysokociśnieniową chromatografię cieczową (HPLC)
- ultrasprawną chromatografię cieczową (UPLC)
- ultraszybką chromatografię cieczową (UFLC)
- szybko rozdzielczą chromatografię cieczową (RRLC)
- ultrawysokociśnieniową chromatografię cieczową (UHPLC)
Odmianą metod chromatografii jest również chromatografia flash. Jej początki sięgają lat siedemdziesiątych ubiegłego wieku. Dzisiaj metoda ta została całkowicie zautomatyzowana, dzięki czemu znacznie przyśpieszono cały proces, jak i zwiększono wydajność samej izolacji i oczyszczania produktów. Współczesna aparatura do chromatografii flash jest dostosowywana do indywidualnych potrzeb każdego użytkownika i umożliwia nam planowanie procesów rozdziału nawet w skali mikrogramów.
Standardowy system do tej metody składa się z:
- podajnika eluentów
- modułu pomp
- stacji kontrolnej
- detektora
- kolektora frakcji
Spośród detektorów najczęściej stosowane są UV, UV/Vis, ELSD (detektor aerozolowy promieniowania rozproszonego; schemat obok). Każdy z nich może być stosowany samodzielnie, jednak eksperci zgadzają się ze sobą, że najlepsze efekty pomiarów otrzymuje się stosując połączenie detektorów UV/Vis i ELSD.
Ci sami eksperci podkreślają, że chromatografia flash charakteryzuje się dużo większą wydajnością i rozdzielczością, przy jednocześnie maksymalnie skróconym czasie trwania całej analizy (z około 2 godzin do 45 minut). Dodatkowo materiał oczyszczany jest w dużych ilościach, a stopień jego oczyszczenia przekracza 90%. Ponadto zaletą tej techniki są relatywnie niskie koszty eksploatacyjne (system zużywa wprawdzie większe ilości rozpuszczalników, ale nie muszą one być najwyższej czystości co znacznie zmniejsza koszty analizy).
Warto zastanowić się jak wygląda praktyczne wykorzystanie tej techniki w codziennej pracy. Również i o tym można było usłyszeć na Poznańskiej konferencji. Doktor Jacek Olczak w czasie swojego wykładu nt. „Chromatografi flash w projektach chemii medycznej” opowiedział o dwóch dużych projektach medycznych w których brał udział i w trakcie których wykorzystana została w/w technika. Pierwsze badania skupiały się na poszukiwaniu analogów inhibitora arginazy. Arginaza jest enzymem z grupy hydrolaz, który uczestniczy w wielu reakcjach enzymatycznych przez co pełni rozmaite funkcje w organizmie (m.in. jest markerem stanu zapalnego). W trakcie prowadzonych prac wytypowano strukturę wiodącą związku który stał się potencjalnym kandydatem- matrycą poszukiwanych inhibitorów. Na jego bazie grupa chemików syntetyzowała różne wariant analogów (łącznie ponad 300 związków chemicznych), które następnie poddawano testom komórkowym (in vitro). Efektem badań było otrzymanie związku chemicznego, który wykazywał dużą aktywność biologiczną (duża inhibicja działania arginazy) przy 10-krotnie mniejszym stężeniu niż substancja wyjściowa (struktura wiodąca).
Drugi projekt opisany przez dr Olczaka polegał na zaprojektowaniu leku, który byłby inhibitorem pompki efluksyjnej (EPI) w komórkach bakterii. Pompka efluksyjna jest to struktura komórkowa odpowiedzialna za usuwanie substancji toksycznych (w tym również antybiotyków) poza obszar komórki. Również w tym przypadku prace rozpoczęto od wytypowania struktury wiodącej leku, na podstawie której rozpoczęto prace nad otrzymaniem analogów o korzystniejszym działaniu biologicznym. Jak się okazało w trakcie eksperymentu, jeden z otrzymanych analogów w testach bakteriologicznych charakteryzował się bardzo dużą redukcją ilości bakterii Pseudomonas aeruginosa. Niestety późniejsze testy na zwierzętach wykazały negatywny wpływ tej substancji na funkcjonowanie nerek badanych osobników, przez co związek ten został wykluczony z dalszych badań. W obu opisanych doświadczeniach chemicy w celu oczyszczenia mieszanin syntetyzowanych analogów wykorzystywali metodę chromatografii flash.
Konferencja w Poznaniu zakończyła się praktyczną prezentacją nowoczesnego sprzętu do przeprowadzania rozdziału metodą chromatografi flash.
Michał Szlis
KOMENTARZE