Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
26 stycznia br. na łamach „Cell” ukazał się artykuł opisujący wyniki badań nad tworzeniem chimer ludzko-świńskich z wykorzystaniem ludzkich komórek macierzystych. W powstałej wokół tego wydarzenia burzy medialnej ciężko niekiedy o rzetelne informacje z kompleksowym wytłumaczeniem podstawowych określeń. W tym artykule przyjrzymy się oryginalnej publikacji i uporządkujemy fakty oraz terminologię.

 

O tworzeniu chimer ludzko-świńskich pisaliśmy pół roku temu w tym artykule – na wstępie odsyłamy zatem do lektury, aby zapoznać się z ideą badań.

Najnowsza publikacja opisuje wyniki badań prowadzonych w Salk Institute for Biological Studies (CA, USA), w którym podjęto się tworzenia chimer międzygatunkowych: początkowo wprowadzając komórki szczurze do embrionu myszy oraz testując powstawanie chimer szczurzo-świńskich i mysio-świńskich, a następnie wprowadzając komórki ludzkie do embrionu bydła domowego oraz embrionu świni.

 

Przede wszystkim należy usystematyzować stosowaną terminologię:

  • Otrzymane w ten sposób embriony (a w przypadku połączenia komórek szczurzych i mysich – także dorosłe osobniki) nie są hybrydami, ani nie są krzyżówkami – ponieważ te powstają w wyniku krzyżowania dorosłych osobników różnych gatunków zdolnych do rozmnażania płciowego. Są to chimery – czyli organizmy zbudowane z komórek różniących się genetycznie (w tym przypadku – pochodzących od różnych organizmów).

  • W tworzeniu chimer szczurzo-mysich użyto embrionalnych komórek macierzystych szczura (rESCs) lub indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSCs) wprowadzonych do embrionu myszy, natomiast w tworzeniu chimer ludzko-bydlęcych i ludzko-świńskich użyto ludzkich indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (hiPSCs) otrzymanych poprzez reprogramowanie fibroblastów ludzkiego napletka (HFFs). Zastosowane hiPSC, dzięki różnym warunkom hodowli, znajdowały się w stadium naiwnym (2iLD-hiPSCs, NHSM-hiPSCs i 4i-hiPSCs), czyli imitującym pierwotne embrionalne komórki macierzyste, stadium „primed”, czyli wstępnie ukierunkowanych do dalszego różnicowania oraz w stadium pośrednim (FAC-hiPSCs).

  • W terminologii opisującej rodzaj chimery, organizm wymieniony jako pierwszy oznacza dawcę komórek macierzystych, a organizm wymieniony jako drugi oznacza ich biorcę (lub innymi słowy, dawcę blastocysty i gatunek ewentualnej matki-surogatki). Stąd mowa o chimerach szczurzo-mysich lub ludzko-świńskich.

Celem eksperymentów z użyciem gryzoni było utworzenie chimer posiadających specyficzne organy zbudowane z komórek innego gatunku. Jak wygląda opisana procedura tworzenia chimer? Autorzy zastosowali jednostopniowy system międzygatunkowej komplementacji blastocysty składający się z dwóch faz:

  1. Wprowadzenia modyfikacji genetycznej na etapie zygoty mysiej metodą CRISPR-Cas9. Edycja genomu za pośrednictwem ko-iniekcji mRNA Cas9 i specyficznej sekwencji sgRNA prowadziła do inaktywacji specyficznych genów odpowiadających na rozwój poszczególnych organów myszy, takich jak trzustka, wątroba, serce czy oczy.

  2. Wprowadzenia określonej ilości komórek macierzystych do utworzonej blastocysty, a następnie implantacja embrionu w organizmie myszy-surogatki.


Wu, Jun et al. Cell 2017

W przypadku chimer ludzko-bydlęcych i ludzko-świńskich określono jak dotąd generalną zdolność do tworzenia chimer międzygatunkowych. Embriony zwierzęce otrzymano na drodze zapłodnienia in vitro lub, w przypadku świń, także na drodze partenogenezy (dzieworództwa) poprzez sztuczną stymulację elektryczną oocytów. Formacja chimer na etapie blastocysty oceniana była po dwóch dniach hodowli in vitro na drodze: (I) obserwacji mikroskopowej (wprowadzane komórki macierzyste były znakowane fluorescencyjnie), (II) znakowania immunochistochemicznego, (III) amplifikacji gatunkowo-specyficznych markerów DNA mitochondrialnego w reakcji PCR. Jeśli doszło do skutecznego utworzenia chimer na etapie pre-implantacyjnym, w przypadku chimer ludzko-świńskich oznaczano także procent chimer na etapie 21-28 dniowego embrionu, po wprowadzeniu blastocysty do organizmu lochy-sugoratki. W tym celu ciąża była przerywana, a płód poddawany sekcji i badaniom.


Wu, Jun et al. Cell 2017

 

Wyniki przeprowadzonych badań:

  • Chimery szczurzo-mysie otrzymano z 20% wydajnością, przy czym największy odsetek komórek szczurzych w docelowych organach zaobserwowano w sercu (na poziomie 10%). W przypadku chimer szczurzo-mysich płody rozwijały się prawidłowo, a dorosłe osobniki dożywały nawet ok. 2 lat, co jest normalną długością życia myszy, a w komórkach szczurzych obserwowano regularne markery starzenia.

  • Nie udało się otrzymać chimer gryzoni i świni, a embriony otrzymane na drodze komplementacji blastocysty odznaczały się opóźnieniem rozwoju.

  • Udało się otrzymać chimery ludzko-bydlęce na etapie pre-implantacyjnym, jednak nie badano ich na etapie post-implantacyjnym. W tworzeniu chimer uczestniczyły jedynie hiPSCs w stadium naiwnym lub pośrednim, przy czym wydajność była zależna od rodzaju zastosowanych komórek (najlepsza dla NHSM-hiPSCs i 4i-hiPSCs).

  • Udało się otrzymać chimery ludzko-świńskie, zarówno na etapie pre- jak i post-implantacyjnym. Podobnie jak wyżej, największą wydajność na etapie pre-implantacyjnym otrzymano dla komórek w stadium naiwnym i pośrednim. W stadium post-implantacyjnym, transfer 1466 blastocyst poskutkował rozwojem 186 embrionów. Ponad połowa z nich wykazywała opóźnienie rozwoju. Jedynie u 67 embrionów zaobserwowano obecność komórek ludzkich, z czego tylko 17 wykazywało normalny rozmiar i morfologię. Większość normalnie rozwijających się embrionów ostatecznie nie zawierała komórek ludzkich. Wśród poprawnie rozwijających się chimer największy odsetek stanowiły te, do których wprowadzono komórki w stadium pośrednim (FAC-hiPSCs). Dla komórek tych skutecznie oznaczono markery różnicowania do różnych linii komórkowych.

Podsumowując, w tworzeniu chimer ludzko-świńskich najskuteczniejsze okazały się hiPSCs w stadium pośrednim, które następnie wykazały zdolność różnicowania do różnych typów komórek. Mimo to, wydajność tworzenia chimer tego typu jest wciąż dużo niższa niż w przypadku chimer szczurzo-mysich. Autorzy sądzą, że nie bez znaczenia jest tutaj środowisko rozwoju embrionu, jak również dystans ewolucyjny dzielący badane gatunki. Niemniej, świnia wciąż pozostaje cennym modelem badawczym, ze względu na podobieństwo świńskich i ludzkich organów.

Szczegółowy opis badań i wyników znajduje się w artykule „Interspecies Chimerism with Mammalian Pluripotent Stem Cells” autorstwa Jun Wu i wsp.

Niniejszy artykuł porządkuje jedynie fakty i terminy przedstawione w publikacji, nie dotykając przy tym kwestii etycznych, którym zapewne należałoby poświęcić osobną wypowiedź. Niemniej, mamy nadzieję, że powyższa lektura pozwoli z większym zrozumieniem spojrzeć na popularnonaukowe opisy przytoczonych badań.

Źródła

Interspecies Chimerism with Mammalian Pluripotent Stem Cells

Wu, Jun et al. Cell , Volume 168 , Issue 3 , 473 - 486.e15
KOMENTARZE
Newsletter