Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
CRISPR - molekularne nożyce do DNA
CRISPR - molekularne nożyce do DNA
W ostatnim czasie pojawia się wiele doniesień z obszaru inżynierii genetycznej, dotyczących modyfikacji materiału genetycznego komórek, zarówno roślinnych, jak i zwierzęcych. Nowe światło na tę dziedzinę rzuciło zastosowanie technologii CRISPR okrzykniętej „molekularnymi nożycami” ze względu na możliwość wprowadzania modyfikacji w określone sekwencje DNA. Warto się więc przyjrzeć bliżej molekularnemu mechanizmowi działania systemu, który ma szansę zrewolucjonizować m.in. terapię genową.

 

CRISPR [1,2,3,4] jest to sekwencja skupionych, regularnie oddalonych, krótkich powtórzeń palindromowych oddzielających sekwencje DNA rozpoznawanych jako obce (nazywanych z ang. spacers), związanych z genami dla białek (Cas). Stanowi adaptacyjny, immunologiczny system obrony występujący w bakteriach oraz archeonach odkryty w 1987 roku. Działanie systemu polega na „zapamiętywaniu” specyficznej sekwencji obcego kwasu nukleinowego związanej z przebytą infekcją i degradacją obcego materiału genetycznego podczas kolejnej inwazji.

Odporność związaną z CRISPR-Cas można podzielić na trzy etapy [1,2,3,4], z których pierwszy stanowi adaptację i polega na włączeniu krótkich fragmentów obcego DNA (zależnie od organizmu 21-72 nukleotydy) do sekwencji CRISPR na końcu liderowym locus jako nowe powtórzenia – w ten sposób zostaje zapewniona pamięć obcej sekwencji. Za wybór konkretnego fragmentu do „zapamiętania” odpowiedzialna jest prawdopodobnie sekwencja PAM (protospacer adjacent motif), znajdująca się obok sekwencji spacer i składająca się z krótkiego fragmentu kwasu nukleinowego (2-5nt), którego nie zawiera genom gospodarza. PAM różni się także pomiędzy różnymi typami systemu CRISPR-Cas.

Zaobserwowano, że mutacja sekwencji PAM pozwala bakteriofagowi uniknąć działania systemu obrony CRISPR-Cas.

Następnie nowa sekwencja ulega ekspresji wraz z całym systemem białek Cas, prowadząc do wytworzenia kompleksu rybonukleoproteinowego CRISPR (crRNP). U niektórych gatunków bakterii transkrypcja jest inicjowana w sekwencji liderowej – zawierającej sekwencję promotora oraz miejsca wiązania białek regulatorowych. Pierwotny transkrypt CRISPR-RNA (pre-crRNA) zawiera palindromiczne sekwencje CRISPR i tworzy wiele struktur drugorzędowych – spinki do włosów. Następnie ulega obróbce, która różni się w zależności od typu systemu. W końcowym etapie powstają crRNA zawierające pojedynczy spacer z obcym kodem genetycznym.
Jeśli komórka zetknie się ponownie z tym genem, nastąpi przyłączenie specyficznego crRNA stanowiącego kompleks z białkami Cas i degradacja obcego genu – ostatni etap działania systemu CRISPR-Cas.

Białka Cas [2,3,4,5] związane z systemem wykazują dużą różnorodność, przy czym ich funkcje są pokrewne - co wskazuje na wspólne pochodzenie. Możemy wyróżnić dwie grupy: adaptacyjną oraz efektorową.

Pierwsza z nich jest zwykle jednakowa we wszystkich systemach i składa się z dwóch podstawowych białek - Cas1 oraz Cas2 odpowiadających za wytworzenie nowego crRNA. W przeciwieństwie do tego grupę efektorową - odpowiadającą za kierowanie crRNA do celu oraz niszczenia inwazyjnego kodu genetycznego - charakteryzuje wysoka zmienność. Wyróżniamy tutaj, zgodnie z ostatnią propozycją systemy należące do dwóch klas:

- Klasa pierwsza, obejmująca typy I, III oraz IV – posiadające kompleksy wielu podjednostek efektorowych składających się z wielu białek Cas.

Typ I jest dodatkowo podzielony na siedem podtypów (I-A do I-F oraz I-U). Za obróbkę pierwotnego transkryptu pre-crRNA odpowiada w tym przypadku wielopodjednostkowy kompleks Cascade, w którego skład wchodzi endorybonukleaza Cas6. Wszystkie podtypy zawierają białko Cas3, odpowiadające za rozcinanie DNA rozpoznanego przez system CRISPR.

Typ III został podzielony na podtypy A i B, z których ostatnio wyodrębniono dodatkowo podtyp C i D. Podobnie jak w typie I udział w obróbce pre-crRNA bierze białko Cas6. Jednak w tym przypadku charakterystycznym białkiem odpowiedzialnym za niszczenie obcego materiału genetycznego jest Cas10.

Typ IV został niedawno wyodrębniony i nie jest dokładnie scharakteryzowany. Można w tym przypadku wyróżnić dwa warianty różniące się zawartością helikazy z rodziny DinG.

- Klasa druga – tutaj należy typ II oraz V, które składają się z pojedynczego, dużego białka Cas oraz zawierają znacznie mniejszą liczbę genów w porównaniu z klasą I.

Do typu II należy duże (od 950 do 1600 aminokwasów), wielodomenowe białko Cas9 zawierające dwie domeny nukleazowe – RuvC podobną oraz HNH (Mcr podobną), których cel stanowi rozszczepianie DNA. Ten typ systemu CRISPR zaobserwowano tylko u bakterii.

Zostały wprowadzone w tym przypadku także trzy podtypy (II-A, II-B oraz II-C), z których II-C jest najbardziej rozpowszechniony. Dla podtypu II-A charakterystyczne jest białko Csn2 odpowiedzialne za integrację nowych sekwencji rozdzielających. II-B charakteryzuje białko Cas4 wykazujące aktywność egzonukleazy. Natomiast w przypadku II-C nie zaobserwowano dodatkowych genów poza podstawowymi genami białek Cas1, Cas2 i Cas9. W odróżnieniu od klasy I, w tym przypadku za obróbkę pre-crRNA nie jest odpowiedzialny wielobiałkowy kompleks, ani endonukleaza, tylko krótki fragment częściowo komplementarnego do powstającego RNA – tracrRNA [6]. Fragment RNA złożony z dwuniciowego fragmentu crRNA i tracrRNA jest substratem dla bakteryjnej RNazy III, która dodatkowo wymaga do swojego działania obecności białka Cas9. Następnie dojrzały kompleks crRNA, tracrRNA oraz Cas9 bierze udział w degradacji obcego DNA.

Jako typ V sklasyfikowano system CRISPR, w którego skład wchodzi białko Cpf1 zawierające domenę RuvC wykazujące działanie endonukleazy i kierowane za pomocą komplementarnego RNA na docelowe DNA – rozcinając je w odpowiednich miejscach. Białko Cpf1 nie zawiera domeny HNH, co odróżnia je od Cas9 i głównie na tej podstawie został wyodrębniony osobny typ systemu.

Ze względu na brak wielobiałkowego kompleksu oraz prostszy mechanizm działania system CRISPR typu II (podtyp II-C) znalazł zastosowanie w badaniach, których celem jest edycja genomu komórek eukariotycznych [2,5].

Kluczowym etapem działania systemu CRISPR w inżynierii genetycznej jest uzyskanie podwójnego pęknięcia nici DNA w odpowiednich miejsca, co jest możliwe dzięki zastosowaniu białka Cas9 – głównej składowej systemu typu II. Zaobserwowano także, większą wydajność podczas zastosowania systemu pochodzącego z Sterptococcus pyogenes.

Naprawa uszkodzonych nici może przebiegać na dwóch różnych mechanizmach. Pierwszym z nich jest niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), w wyniku którego na drodze insercji lub delecji może dochodzić do zmiany ramki odczytu i co może spowodować powstanie niefunkcjonalnego białka lub przedwczesnego kodonu stop kończącego translację.

Innym mechanizmem naprawy podwójnych pęknięć jest rekombinacja homologiczna (HDR) – w tym przypadku naprawa przebiega z użyciem częściowo komplementarnego fragmentu DNA, który może zostać użyty w celu rekombinacji uszkodzonej nici – dzięki temu możliwe jest wprowadzenie insercji, delecji, a także mutacji punktowych.

Co ciekawe, nukleaza Cas9 (w przeciwieństwie do systemów ZFN i TALEN) wprowadza również dwuniciowe pęknięcia w metylowanym DNA [2]. Cechami wskazującymi na wyższość systemu CRISPR-Cas9 jest wysoka precyzja, pozwalająca na wprowadzenie pęknięć w ściśle określonych miejscach dzięki zastosowaniu komplementarnego RNA jako „przewodnika”, a także możliwość jednoczesnej edycji kilku miejsc w genomie.

W przypadku systemu CRISPR-Cas9 wykorzystywanego w inżynierii genetycznej, pomijany jest etap adaptacji [2] – wszystkie elementy systemu muszą zostać wprowadzone do komórki poprzez transformację. Jednocześnie wykazano, że do poprawnego działania systemu CRISPR opartego o typ II, wystarcza wprowadzenie do komórek eukariotycznych crRNA, tracrRNA oraz genu dla białka Cas9. Nie jest wymagana bakteryjna RNaza III – przypuszcza się, że jest zastępowana przez nukleazę występującą w komórkach eukariotycznych. Ponadto, system ten może być jeszcze bardziej uproszczony dzięki zastosowaniu sgRNA (single-guide RNA), zawierającego jednocześnie sekwencję crRNA oraz tracrRNA. Nukleotydy znajdujące się na końcu 5’ (około 20) odpowiadają za rozpoznanie docelowej sekwencji DNA.

Podstawowe ograniczenie stanowi konieczność zastosowania sekwencji PAM bezpośrednio za docelowym DNA, które różnią się w zależności od pochodzenia białka Cas9 np.: dla systemu z S. pyogenes najbardziej wydajne jest cięcie z motywem PAM 5’-NGG, natomiast dla Neisseria meningitidis – 5’-NNNNGATT. Częściowe ułatwienie stanowi zastosowanie mutantów SpCas9, które rozpoznają inną sekwencję PAM w porównaniu z typem dzikim.

Wprowadzenie składowych systemu CRISPR-Cas9 do komórek docelowych następuje przy użyciu plazmidu zawierającego geny dla sgRNA oraz Cas9 umieszczonych pod kontrolą odpowiedniego promotora, rozpoznawanego przez endogenną polimerazę RNA III. W ten sposób uzyskuje się tylko czasową ekspresję egzogennych genów w komórce, co jest jednak wystarczające do wprowadzenia trwałych zmian w genomie. Plazmid jest wprowadzany do komórki przy użyciu szeregu technik wirusowych oraz nie-wirusowych, w zależności od pochodzenia komórek docelowych (roślinne, zwierzęce) oraz typu prowadzonych badań (in vitro, in vivo, ex vivo).

Niestety pomimo wysokiej specyficzności metody, ta jako jedyna działa zgodnie z modelem parowania zasad Watsona-Cricka, w porównaniu z innymi technikami jak ZFN czy TALEN, które są oparte na oddziaływaniach białko-DNA. Istnieje również duże ryzyko cięcia nici DNA w niepożądanych miejscach (loci). Naukowcy próbują poradzić sobie z tym problemem, dzięki zastosowaniu zmodyfikowanego białka Cas9 – wprowadzenie mutacji punktowej znoszącej aktywność jednej z domen nukleazowych [7] (D10A lub H840A odpowiednio dla RuvC oraz HNH). Białko takie nazywane Cas9n (nikaza) tnie wówczas tylko jedną nić DNA, pozwalając na wykorzystanie rekombinacji homologicznej. Wykorzystuje się także dwie sekwencje sgRNA przyłączające się w miejscach sąsiadujących w obu niciach, co dodatkowo zwiększa specyficzność działania.

Istnieją próby wykorzystania białka fuzyjnego Cas9 z domeną nukleazową FokI [8] (działającą jako dimer), co także podnosi specyficzność działania systemu. Jednocześnie wiąże się to z dodatkowymi ograniczeniami, ponieważ niezbędna jest obecność dwóch sekwencji PAM.

System CRISPR-Cas9, jak wynika z powyższego opisu, wydaje się być ciekawą alternatywą dla dotychczas stosowanych metod edycji genomu. Warto wyraźnie podkreślić, że jako jedyna działa na zasadzie komplementarnego parowania zasad pomiędzy DNA i RNA, co warunkuje jej wysoką specyficzność oraz możliwość wprowadzenia mutacji w ściśle określonych miejscach, co jest znacznie trudniejsze w przypadku metod wykorzystujących oddziaływania białko-DNA. W związku z tym podejmowane są ostatnio liczne badania nad zastosowaniem systemu CRISPR zaczynając od genetycznie modyfikowanej żywności, poprzez walkę z antybiotykoopornością (unieszkodliwiając w ten sposób m.in. geny oporności na antybiotyki) i zakażeniami wirusowymi, aż do terapii genowej oraz tworzenia modeli chorób w celu dokładnego poznania ich mechanizmów. Opisywana metoda oczywiście wiąże się z pewnymi ograniczeniami oraz negatywnymi skutkami stosowania, jednakże jak wspomniano powyżej - równolegle z pierwszymi zastosowaniami w modyfikacji komórek eukariotycznych - rozpoczęto także badania nad przezwyciężeniem ograniczeń.

Źródła

Literatura:

 

1. Makarova KS, Wolf YI, Alkhnbashi OS, et al. „An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems”. Nat Rev Microbiol. 2015 Nov;13(11):722-36. doi: 10.1038/nrmicro3569.

 

2. Maria Czarnek, Joanna Bereta. „The CRISPR-Cas system – from bacterial immunity

to genome engineering” Postepy Hig Med Dosw (online), 2016; 70: 901-916

 

3. Frank Hille, Emmanuelle Charpentier. „CRISPR-Cas: Biology, Mechanisms and Relevance”. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 371 (1707). 2016 Nov 05.

 

4. Shmakov S, Abudayyeh OO, Makarova KS. „Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems”. Mol Cell. 2015 Nov 5;60(3):385-97. doi: 10.1016/j.molcel.2015.10.008.

 

5. Rath D, Amlinger L, Rath A, et al. „The CRISPR-Cas immune system: biology, mechanisms and applications”. Biochimie. 2015 Oct;117:119-28. doi: 10.1016/j.biochi.2015.03.025.

 

6. Deltcheva E, Chylinski K, Sharma CM, et al. „CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III”. Nature. 2011;471(7340):602-607. doi:10.1038/nature09886.

 

7. Ran FA, Hsu PD, Lin C-Y, et al. „Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity”. Cell. 2013;154(6):1380-1389. doi:10.1016/j.cell.2013.08.021.

 

8. Tsai SQ, Wyvekens N, Khayter C, et al. „Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing”. Nature biotechnology. 2014;32(6):569-576. doi:10.1038/nbt.2908.

 

Grafika:

 

https://www.aati-us.com/instruments/fragment-analyzer/crispr/

 

https://www.quora.com/Does-gene-editing-work

 

http://www.nature.com/nrmicro/journal/v9/n6/fig_tab/nrmicro2577_F1.html

 

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:CRISPR-Cas9_Editing_of_the_Genome_(26453307604).jpg

KOMENTARZE
Newsletter