Biotechnologia.pl: Czy mógłby Pan pokrótce opowiedzieć o zadaniach badawczych jakie realizowane są u Pana w pracowni?

Dr Marcin Nowotny: W naszym laboratorium zajmujemy się białkami, które działają na kwasy nukleinowe, czyli na RNA i DNA. W szczególności interesują nas procesy naprawy DNA oraz enzymy, które zajmują się przekształcaniem RNA do DNA. Mowa tutaj o odwrotnej transkryptazie tłumaczącej pojedynczą nić RNA na podwójną helisę DNA, enzymu niezwykle istotnego dla funkcjonowania retrowirusów, np.: dla HIV. Prowadzimy kompletny cykl prac od uzyskania białka aż do określenia jego struktury. Warto dodać, że prawie zawsze naszym biokrystalograficznym eksperymentom towarzyszą również dodatkowe badania biochemiczne. W ten sposób mamy szansę potwierdzić, że wyniki analiz krystalograficznych odzwierciedlają rzeczywistą konfigurację badanych cząsteczek. W naszych badaniach zajmujemy się również transpozycją DNA. Jest to proces, w którym fragment DNA w genomie autonomicznie, samodzielnie przenosi się w inne miejsce. Taki transpozon koduje białka, zajmujące sie wycięciem, lub skopiowaniem fragmentu DNA i wklejeniem go gdzie indziej. Transpozony są jednymi z najsilniej kształtujących architekturę genomu czynników. Na przykład u człowieka około 45% DNA pochodzi od elementów, które się samodzielnie kopiują i rozprzestrzeniają. Szczególnie aktywne są retrotranspozony, namnażające się przez proces odwrotnej transkrypcji, w którym udział biorą badane przez nas odwrotne transkryptazy.

Według danych dostępnych w bazie PubMed dowiedziałam się, że sporą część tematyki naukowej, realizowanej przez Państwa zajmują RNAzy H?

RNAzy H to niewielkie nukleazy, przecinające kwas nukleinowy, który zawiera zarówno RNA, jak i DNA. Takie kwasy nukleinowe występują stosunkowo rzadko w komórce na różnych etapach powielania materiału genetycznego, zazwyczaj w procesie replikacji DNA. W biologii nazywamy je hybrydami DNA\RNA. RNAza H jest enzymem, który bardzo specyficznie rozpoznaje hybrydę RNA\DNA i ją hydrolizuje, co ma ogromne znaczenie w kilku procesach. DNA w komórce jest powielane za każdym razem, gdy komórka się dzieli. Enzymy, które katalizują ten proces to polimerazy DNA. Polimerazy nie są jednak w 100% dokładne i czasami dodatkowo włączają pojedyncze nukleotydy. Innymi słowy, gdy takie DNA jest powielane, to co jakiś czas taka polimeraza się myli i włącza pojedynczą resztę RNA. Dodam, że reszty RNA i DNA różnią się od siebie tylko jedną grupą chemiczną, tzw. grupą 2’OH. Włączanie rybonukleotydów jest bardzo niebezpieczne, ponieważ są one bardzo podatne na hydrolizę, następstwem której jest pojawienie się pęknięcia DNA — niezwykle niebezpiecznego uszkodzenia materiału genetycznego. Istnieje zatem konieczność usunięcia takich pojedynczych nukleotydów i taką funkcję pełni RNaza H2. W 2010 roku opublikowaliśmy pierwsze struktury krystalograficzne tego enzymu w kompleksie z kwasem nukleinowym i dokładnie pokazaliśmy w jaki sposób ten enzym działa. Ogromnym sukcesem było odkrycie tego w jaki sposób RNAza H2 pośród tysięcy reszt prawidłowego DNA potrafi w sposób niezwykle specyficzny znaleźć tę jedną resztę RNA. Było to — jak do tej pory, jedno z ważniejszych osiągnięć naszej pracowni. Potem opisaliśmy strukturę krystalograficzną ludzkiej RNAzy H2, która jest o wiele bardziej skomplikowana, niż ta funkcjonująca u bakterii — zawiera trzy podjednostki białkowe. Jest to bardzo ważny enzym, gdyż jego mutacje prowadzą do chorób genetycznych. Byliśmy w stanie wyjaśnić, gdzie te mutacje znajdują się w strukturze białka i w jaki sposób zaburzają one jego funkcjonowanie.

Czy badania krystalograficzne, które państwo wykonują próbowano przenieść na przesiewowe np. analizy polimorfizmów u ludzi?

Polimorfizmów akurat nie badamy, ale to co zrobiliśmy, to zbadaliśmy 29 znanych mutacji związanych z występowaniem syndromu Aicardi-Goutieres, którego etiologia powiązana jest z dysfunkcją RNazy H2. My ustaliliśmy położenie każdej z tych mutacji  w strukturze białka. Na tej podstawie byliśmy w stanie stwierdzić, że mutacja A, która występuje u pacjenta X powoduje występowanie określonych defektów w RNAzie H2. A inna mutacja B, hamuje aktywność, a tym samym mechanizm katalityczny i działanie RNAzy H2. Tym samym byliśmy w stanie połączyć strukturalne dane z wyjaśnieniem tego, co te konkretne mutacje zaburzają w funkcjonowaniu białka.

A co ze specyficzną rolą RNAzy H jako domeny funkcjonującej w odwrotnych transkryptazach?

Kiedy jednoniciowy kwas RNA jest tłumaczony na dwuniciowe DNA po drodze pojawia się hybryda RNA\DNA. Jest to kwas nukleinowy w którym jedna nić to RNA, a druga DNA. W pośrednim etapie odwrotnej transkrypcji, nić RNA musi być usunięta, żeby umożliwić syntezę drugiej nici DNA i za to odpowiada właśnie domena RNAzy H. Badając odwrotną transkryptazę, jako jeden z głównych enzymów wirusa HIV, zawsze pamiętamy, że wyniki naszych eksperymentów mogą być narzędziem do realizacji nadrzędnego celu, którym jest np. stworzenie nowego leku przeciwko wirusowi HIV. Wirus HIV koduje jedynie 4 aktywności enzymatyczne. Na rynku dostępne są już skuteczne leki, których działanie polega na hamowaniu trzech z tych aktywności. RNAza H jest ostatnią aktywnością enzymatyczną, dla której, mimo ogromnego wysiłku wielkich firm farmaceutycznych, nie udało się znaleźć inhibitorów. Chcieliśmy się dowiedzieć więcej na temat tego enzymu i funkcjonowania domeny RNAzy H w odwrotnej transkryptazie. Dlatego też stosujemy kombinacje bardzo zaawansowanych badań biochemicznych i strukturalnych, żeby lepiej zrozumieć te zagadnienia. Są to rzeczy niepublikowane i nie chciałbym jakoś bardzo szczegółowo na ten temat opowiadać, ale jest to jeden z intensywnie badanych tematów w naszym laboratorium.

A co z RNAzami H, które występują w innych, niekoniecznie patologicznych odwrotnych transkryptazach?

Enzym z wirusa HIV jest enzymem dość szczególnym — jest to jedyny poznany dotąd patogenny retrowirus u ludzi. W innych retrowirusach odwrotne trankryptazy działają zupełnie inaczej. W styczniu tego roku opublikowaliśmy pracę, w czasopiśmie Nucleic Acid Research, w której opisaliśmy mechanizm działania odwrotnej transkryptazy z wirusa Xenotropic Murine Leukemia-Related Virus. Ta odwrotna transkryptaza zachowuje się zupełnie inaczej niż odwrotna transkryptaza z wirusa HIV. Stosując metody krystalograficzne i niskokątowe rozpraszanie promieniowania Roentgena scharakteryzowaliśmy mechanizm działania domeny RNAzy H w tym enzymie.

Czy w swoich badaniach nad enzymami współpracują państwo również z bioinformatykami?

Tak, pewnie dlatego, że bioinformatyka jest nauką, która działa na różnych poziomach. Jest bioinformatyka, ustalająca analizująca kolejność nukleotydów w łańcuchu kwasu nukleinowego, ale jest i bioinformatyka będąca podstawowym narzędziem do analizy struktur białek. My sami używamy narzędzi bioinformatycznych na przykład po to, aby zdefiniować najlepsze cele do krystalizacji. W krystalografii jest trochę tak, że jeżeli interesujemy się jakimś enzymem, białkiem bądź kompleksem, to najczęściej nie ma znaczenia czy rozwiążemy jego strukturę z człowieka, czy z muchy. Struktury, które badamy są zazwyczaj bardzo mocno zachowane, nawet jeżeli nie ma zbyt dużego podobieństwa na poziomie sekwencji, to struktury badanych przez nas struktur potrafią być nieomal identyczne. My identyfikujemy takie cele krystalograficzne, które mają największe szanse, że stworzą kryształy. To jest taki element, którego nie jesteśmy w stanie do końca kontrolować, jest to po prostu kwestią doświadczenia i sprawdzenia setek, a nawet tysięcy różnych warunków krystalizacyjnych, różnych kombinacji substancji chemicznych, które będą promować formowanie kryształu. W naszych badaniach zastosowanie narzędzi bioinformatycznych miało było również możliwe dzięki lokalnej współpracy z profesorem Januszem Bujnickim. Jego główne zainteresowania naukowe, to enzymy oddziałujące z kwasami nukleinowymi. Nasza pracownia miała nim wspólny projekt, w którym profesor Bujnicki in silico zaprojektował takie RNAzy H, które tną określoną sekwencję kwasu nukleinowego. Do tej pory takie enzymy nie były dostępne, a istnieje dla nich sporo potencjalnych zastosowań . Dzięki zaprojektowaniu łączenia domeny rozpoznającej konkretną sekwencję i jej połączenia z domeną RNAzy H, stworzyliśmy taki enzym, który tnie bardzo specyficznie sekwencje. Wyniki naszej pracy zostały opublikowane i są obecnie patentowane. Tutaj można wskazać aplikacyjny potencjał wykonywanych przez nas eksperymentów.

Czy jest to jedyny pierwiastek aplikacyjności w pańskiej działalności naukowej?

Większość naszej działalności to badania podstawowe i ich wyniki chcemy publikować. Ale mamy również bliską współpracę z firmami w Polsce, np. z firmą ADAMED, w większości tych współprac jesteśmy podwykonawcami. Krystalografia jest potężnym narzędziem tworzenia nowych leków i może być używana do poszukiwania nowych cząsteczek. Chemik, kiedy projektuje nową cząsteczkę, która ma być mocniejszym inhibitorem, oczekuje od nas zwizualizowania oddziaływania tej cząsteczki np.: z białkiem, które chce zahamować. Mam takie wewnętrzne przekonanie, że nauka jest napędzana ciekawością i chęcią poznania tego jak działa przyroda, co przekłada się przede wszystkim na badania podstawowe. Czuję jednak potrzebę, aby to co robimy miało w krótszej, bądź dłuższej perspektywie przełożenie na coś praktycznego, użytecznego i ważnego dla społeczeństwa. Zapewne jest to spowodowane tym, że dużo naszych badań koncentruje się na naprawie DNA. Naprawa DNA jest procesem, który zapobiega powstawaniu mutacji, a w dłuższej perspektywie rozwojowi powstawaniu nowotworów. Co ciekawe bardzo wiele terapii przeciwnowotworowych uderza w mechanizmy naprawy DNA. Nie oznacza to jednak, że w trakcie naszych badań odkryjemy lek na nowotwory. Możemy jednak dostarczyć podstawowej wiedzy, którą firmy farmaceutyczne i inne laboratoria wykorzystają, tak aby nad takimi terapiami pracować. Ponadto część naszej energii jest skierowana właśnie na współpracę i pracę nad projektami, które są nakierowane na tworzenie inhibitorów, potencjalnych leków. Moim zdaniem jesteśmy dość efektywnymi partnerami w takich działaniach, ponieważ dostarczamy wyników badań strukturalnych cząsteczek. Moja wizja uprawiania nauki, to przede wszystkim nauki podstawowe. Większość odkryć wzięła się z badań podstawowych i to one są koniecznym fundamentem do rozwoju badań stosowanych.

Życzymy sukcesów i powodzenia w dalszej pracy. Dziękujemy za rozmowę.

Wywiad przeprowadziła dr Marzena Szwed, redaktor naukowy portalu Biotechnologia.pl