Krystalografia rentgenowska, Magnetyczny Rezonans Jądrowy (NMR) i kriomikroskopia elektronowa (cryo-EM) stanowią trzy znane obecnie metody poznawania struktury makromolekuł biologicznych na poziomie atomowym. Ponieważ NMR posiada istotne ograniczania eksperymentalne a cryo-EM stanowi wciąż metodę przyszłości, krystalografia rentgenowska jestmotorem badań strukturalnych układów biologicznych od czasu przełomowych pracMaxaPerutza i Johna Kendrew prowadzonych w latach pięćdziesiątych XX wieku. Dynamiczny rozwój metod eksperymentalnych i obliczeniowych zaowocował szeregiem spektakularnych odkryć uhonorowanych m.in. kilkunastoma nagrodami Nobla za badania prowadzone przy pomocy metod krystalograficznych. Pomimo faktu iż do chwili obecnej w publicznych bazach danych zdeponowano ponad 100 tysięcy struktur białek,badania krystalograficzne wciąż przynoszą nowe, znaczące odkrycia rozwijając naszą wiedzę o molekularnych podstawach funkcjonowania organizmów żywych. Równolegle, krystalografia posiada ugruntowaną pozycję w przemyśle farmaceutycznym gdzie stanowi niezastąpioną metodę wspomagającą przy projektowaniu nowych leków.

Badaniami strukturalnymi, a w szczególności krystalografią rentgenowską, zainteresowałem siępodczas realizacjipracy doktorskiej. Część eksperymentów realizowałem w ramach staży naukowych w grupie prof. Tadeusza Holaka będącej częścią laboratorium prof. Roberta Hubera w Instytucie Maksa-Plancka w Monachium. Zapoznałem się tam z metodologią NMR oraz prowadziłem badania krystalograficzne. Po powrocie do kraju zacząłem organizować zaplecze laboratoryjne na ówczesnym Wydziale Biotechnologii UJ umożliwiające kontynuację badań krystalograficznych. Z czasem zaowocowało to utworzeniem w pełni funkcjonalnego laboratorium krystalograficznego, najpierw w strukturze Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, a obecnie równolegle Małopolskiego Centrum Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego.

Prowadzone przeze mnie Laboratorium Krystalografii Rentgenowskiej obejmuje obecnie zespół 15naukowców realizujących zróżnicowane tematycznie projekty badawcze i badania przemysłowe. Muszę nadmienić iż cały zespół jest bardzo zaangażowany w prowadzone prace co jest niezwykle stymulujące i bez czego badania te nie byłyby z pewnością możliwe w realizowanej skali.Główneprace badawcze są realizowane w ramach projektów finansowanych przez NCN i obejmują charakterystykę mechanistyczno-strukturalną proteinaz o nieznanym mechanizmie katalizy, analizę funkcjonalną i strukturalną proteinaz z rodziny kalikrein, niekanonicznych sub-kieszeni w obrębie miejsca wiążącego substrat w kinazach istotnych w procesie nowotworowym oraz białek adaptorowych uczestniczących w przekazywaniu sygnału w komórkach eukariotycznych.

Przedstawienie założeń powyższych projektów zajęłoby zbyt dużo miejsca dlatego przybliżę tutaj jedynie główne osiągnięcia jednego z zaawansowanych projektów obejmującego charakterystykę proteinaz operonu spl Gronkowca złocistego. Powód dla którego bakteria produkuje jednocześnie sześć homologicznych proteinaz stał się zrozumiały po wykazaniu przez nas odmiennej specyficzności substratowej każdego z tych enzymów. Badania strukturalne pozwoliły na określenie molekularnych determinant specyficzności na tyle precyzyjnie, że obecnie na drodze mutagenezy umiemy w sposób ukierunkowany modyfikować specyficzność w obrębie tej grupy enzymów. Prace te, poza aspektem czysto poznawczym, znalazły także zastosowanie praktycznew postaci wprowadzenia na rynek przy współudziale Centrum Innowacji, Transferu Technologii i Rozwoju UJ (CITTRU UJ)^* oraz BioCentrum sp. z o.o., jednej z proteinaz Spl jako dogodnej alternatywy dla stosowanych dotychczas enzymów do usuwania metek fuzyjnych z białek rekombinowanych. Stosunkowo niedawnoopisaliśmy nietypowy mechanizm aktywacji zymogenów proteinazSpl który scharakteryzowaliśmy szczegółowo stosując połączenie analiz biochemicznych i krystalografii. Obecnie analizujemy zmiany konformacyjne w obrębie miejsca wiązania oksyanionu, które wydają się stanowić nieznany dotąd mechanizm zwiększający specyficzność substratową w obrębie tej grupy enzymów.Staramy się nie ograniczać jedynie do prac krystalograficznych uzupełniając prowadzone badania analizami fizykochemicznymi, biochemicznymi i testami funkcjonalnymi.

{page_break}

Równolegle do realizacji badań „własnych”, staramy się w miarę możliwości zapewnić zaplecze dla naukowców dostrzegających potencjał rozszerzenia interesujących ich zagadnień badawczych poprzez wykorzystanie metod krystalograficznych. Prace te realizujemy zwykle w ramach „doraźnej współpracy” mającej na celu opracowanie struktury krystalograficznej pojedynczego białka, część z nich zamieniło się już jednak w trwałą współpracę i realizację wspólnych projektów długoterminowych. Jesteśmy otwarci na wszelkie interesujące oferty współpracy i zapraszamy do kontaktu wszystkich zainteresowanych rozszerzeniem swoich badań o analizę krystalograficzną.

Kolejny obszar działania Laboratorium stanowią badania rozwojowe i przemysłowe realizowane w ramach grantów NCBiR oraz prac zlecanych przez firmy biotechnologiczne. Szczegółowa tematyka tych prac jest objęta klauzulami poufności, jednak w najogólniejszym zakresie obejmują one ustalanie sposobu wiązania niskocząsteczkowych ligandów dla celów projektowania nowych leków oraz analizy konformacyjnej preparatów biopodobnych dla celów rejestracyjnych. Także w tym zakresie jesteśmy otwarci na współpracę.

Z dzisiejszej perspektywy widzę iż inwestycja w rozwój krystalografii rentgenowskiej białek w ośrodku krakowskim była bardzo udaną decyzją. Dzięki finansowaniu ze środków Unii Europejskiej udało się stworzyć nowoczesne laboratorium pozwalające na prowadzenie ciekawych badań w interesującej dziedzinie nauki. Potencjał badawczy MCB w zakresie krystalografii zostanie z końcem tego roku dodatkowo rozszerzony przez utworzenie laboratorium badawczego Instytutu Maxa-Plancka kierowanego przez dra Sebastiana Glatta, obecnie pracownika EMBL w Heidelbergu. Ponadto na Wydziale Chemii UJ badania krystalograficzne białek są prowadzone przez grupę kierowaną przez prof. Krzysztofa Lewińskiego.Czyni to Kraków liczącym się w kraju ośrodkiem krystalograficznym. Budowa synchrotronu Solarisw bezpośrednim sąsiedztwie Kampusu UJ, pośród wielu innych korzyści naukowych, zapewni niezastąpione zaplecze dla dalszego rozwoju badań krystalograficznych w Małopolsce.

^*Centrum Innowacji, Transferu Technologii i Rozwoju Uniwersytetu (CITTRU UJ) wspiera naukowców zainteresowanych szeroką rozumianą współpracą z biznesem. Więcej informacji: http://www.cittru.uj.edu.pl

Grzegorz Dubin

Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii oraz Małopolskie Centrum Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński