Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Kanały jonowe bez tajemnic. Metoda patch-clamp
Kanały jonowe bez tajemnic. Metoda patch-clamp
Kanały jonowe to integralne białka, których zadaniem jest transport jonów przez błonę komórkową. Badanie czynności kanałów jonowych jest niezwykle istotne z punktu widzenia przepływu impulsów nerwowych. Jedną z najbardziej precyzyjnych metod pomiarowych, która pozwala na ocenę przepływu jonów w pojedynczych kanałach jest opracowana przez Erwina Nehera i Berta Sakmanna na przełomie lat 70. i 80. technika patch-clamp.

W przeszłości do badania aktywności kanałów jonowych wykorzystywano metodę voltage-clamp. Pomiar dotyczył jednak całkowitej powierzchni błony komórkowej, a zatem dawał jedynie uśrednioną informację o funkcji pojedynczych białek.

Obecnie to metoda patch-clamp jest złotym standardem w pracowniach elektrofizjologii. Jej koncepcja zakłada przeprowadzenie pomiaru na bardzo małym skrawku błony, tzw. łatce (ang. patch). Do tego celu używa się elektrody umieszczonej we wnętrzu cienkiej szklanej pipety, której końcówka ma  średnicę rzędu 1µm.

Wnętrze mikropipety wypełnione jest roztworem o składzie zbliżonym do płynu zewnątrzkomórkowego, ponieważ pomiar ma miejsce od zewnętrznej strony komórki. W czasie eksperymentu końcówka mikropipety styka się bezpośrednio z powierzchnią błony, tworząc stabilny kontakt, zarówno pod kątem mechanicznym, jak i elektrycznym.

W takich warunkach elektroda pomiarowa rejestruje prądy płynące przez fragment błony ograniczony przez końcówkę pipety. Liczba kanałów jonowych, które znajdują na takim skrawku jest na tyle mała, że możliwe jest rozróżnienie prądów, które płyną przez pojedyncze kanały.

Należy również zwrócić uwagę na fakt, że badany skrawek błony ma kontakt jedynie z roztworem wypełniającym mikropipetę, nie styka się natomiast z roztworem, w którym umieszczona jest komórka. Nie ma zatem możliwości mieszania się obu roztworów, co zapewnia pomiar prądów w obrębie „łatki” przy określonych stałych stężeniach jonów w płynie zewnątrzkomórkowym.

Konfiguracja techniki patch-clamp, w której rejestracja prądów odbywa się na fragmencie błony ograniczonej od reszty komórki nazywana jest konfiguracją cell-attached. Jest to technika nieinwazyjna. Oznacza to, że wnętrze badanej komórki pozostaje niezmienione w trakcie trwania pomiarów.

– Konfiguracja cel-attached  jest niezwykle użyteczna ponieważ pozwala na pomiary małych prądów  płynących  przez niewielką liczbę kanałów  jonowych  z wysoką rozdzielczością przy stosunkowo niskim szumie – mówi mgr Katarzyna Lebida, pracownik Samodzielnej Pracowni Biofizyki Układu Nerwowego Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu – Za jej pomocą można badać nawet przewodnictwo i kinetykę pojedynczych kanałów oraz  określić jaki wpływ na te parametry mają różnorodne substancje farmakologiczne zbliżone do tych, które mogą wpływać na działanie tych białek w warunkach naturalnych.

W sytuacji, gdy po uzyskaniu konfiguracji cell-attached do elektrody zostanie przyłożone niewielkie podciśnienie, ograniczony końcówką pipety skrawek błony zostanie oderwany. Wówczas istnieje możliwość zastosowania konfiguracji whole-cell. Jej zasada działania jest analogiczna do metody voltage-clamp i pozwala na rejestrację aktywności kanałów jonowych znajdujących się w obrębie powierzchni całkowitej błony komórkowej.

– Niewątpliwą zaletą konfiguracji whole- cell jest możliwość pomiaru prądów jonowych z komórek, których rozmiary są zbyt małe aby można było zastosować metode voltage-clamp. Ponadto pozwala ona badać fizjologiczną rolę kanałów jonowych na przykład poprzez pomiary na skrawkach mózgowych. Warto również podkreślić, iż metoda ta umożliwia badanie komórek niepobudliwych – zwraca uwagę mgr Lebida.

Możliwe jest również uzyskanie dwóch innych konfiguracji: inside-out i outside-out. W odróżnieniu od whole-cell, w obu przypadkach mamy do czynienia z pomiarem prądów na oderwanej łatce błony komórkowej.

W konfiguracji inside-out, którą uzyskuje się bezpośrednio z konfiguracji cell-attached,  wewnętrzna część fragmentu błony (czyli ta, która w konfiguracji cell-attached kontaktowała się z  cytoplazmą)  zwrócona jest teraz w kierunku roztworu zewnętrznego w mikropipecie. Konfigurację outside-out uzyskuje się z konfiguracji whole-cell. W tym przypadku część zewnętrzna oderwanej łatki zwrócona jest w kierunku roztworu w naczyniu pomiarowym.

Konfiguracje whole-cell, outside-out i inside-out są wysoce niefizjologiczne, w szczególności dwie ostatnie techniki, w których oderwany skrawek błony traci fizyczny kontakt z resztą komórki. Ogromną zaletą jest natomiast nieograniczona możliwość zmian składu roztworu zewnętrnzego.

Katarzyna Lebida zwraca uwagę, że konfiguracje outside-out i inside-out pozwalają badać wpływ wielu różnych związków podawanych na tę samą pulę kanałów jonowych w szerokim zakresie stężeń. 

– Pozwala to na uzyskanie informacji nie tylko o jakościowym wpływie badanego związku na receptor, ale też o zmianach konformacyjnych jakim podlega białko kanału pod wpływem danego związku. Warto wspomnieć, iż eksperymentator ma możliwość uzyskania niezwykle dużej rozdzielczości czasowej poprzez zastosowanie na przykład systemu ultraszybkiej perfuzji, co umożliwia uzyskanie warunków porównywalnych do zjawisk fizjologicznych.

Źródła

http://www.leica-microsystems.com/science-lab/the-patch-clamp-technique

Wybrane zagadnienia z biofizyki pod red. S. Miękisza i A. Hendricha

http://www.edu.upmc.fr/medecine/edppntic/Sites_2006/Lachheb_Sahran/patch-clamp.html

http://www.physio.unibe.ch/~streit/group/tools.aspx

KOMENTARZE
Newsletter