Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Jak uniknąć zanieczyszczenia wirusami hodowli komórkowych?
22.06.2013

Zanieczyszczenie wirusowe lub bakteriofagowe hodowli komórkowych to znany problem wielu pracowników laboratoryjnych, naukowców, a nawet firm. Często źródłem kontaminacji kultur bakteryjnych okazują się być składniki medium hodowlanego. O tym jak zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia opowiadała podczas zorganizowanego przez Sartorius Stedim Biotech „Upstream Day-New Technology-Platform for Cell & Microbial Cultures”, Claire Roulin.

Wyróżniamy cztery główne metody pozbywania się wirusów z pożywek hodowlanych. Są to promieniowanie UV, promieniowanie gamma, metody termiczne i filtracja. Każda z wymienionych metod ma swoje zalety i wady. „Najbardziej kłopotliwą metodą dekontaminacji jest promieniowanie gamma. Wymaga ono specjalnej infrastruktury, a pożywki często muszą być przesłane do specjalistycznego ośrodka” — tłumaczy Claire Roulin.

 

Analiza SWOT metody napromieniowywania gamma

Mocne strony

  • tradycyjnie stosowane dla surowic,
  • znana technologia.

 

Słabe strony

  • ograniczona objętość,
  • powstające rodniki mogą wpływać na białka,
  • ograniczona skuteczność przeciwko małym wirusom.

Szanse

  • małe partie pożywek w workach.

 

Zagrożenia

  • w wysokich dawkach negatywnie wpływa na kultury komórkowe,
  • zmniejszanie skali.

 

Pod pojęciem termicznej dekontaminacji kryje się wiele metod obróbki cieplnej pożywek hodowlanych, różniących się między sobą czasem procesu i wysokością zastosowanej temperatury (patrz tabela 1). Najpopularniejsze jednak wciąż pozostaje autoklawowanie oraz HTST.

Tabela 1. Metody obróbki cieplnej pożywek hodowlanych

Metoda

Czas dekontaminacji

Temperatura

zastosowanie

Ogrzewanie na sucho

72 godz.

80°C

używane w przypadku liofilizowanych białek np. czynników koagulacji.

Pasteryzacja

10 godz

60–80°C

Roztwory białek zawierające stabilizatory np. Albuminy.

Autoklawowanie

30 min — 1 godz.

121–134°C

Sterylizacja pożywek mikrobiologicznych.

HTST (High Temperature Short Time) Wysoka temperatura w krótkim czasie

10–200 msec

75–102°C

Popularne w przypadku mediów wykorzystywanych w hodowlach komórkowych.

 

Analiza SWOT metod termicznych

Mocne strony

  • szybkość,
  • wysokie wartości przepływu,
  • znana technologia.

 

 

Słabe strony

  • nieodpowiednie w przypadku związków wrażliwych na ciepło,
  • duże koszty,
  • trudności przy czyszczeniu aparatury,
  • bardzo wysoka temperatura wymagana do zniszczenia małych wirusów.

Szanse

  • duże partie pożywek dla komercyjnych produktów.

Zagrożenia

  • wpływ na właściwości produktu,
  • kontrola temperatury.

 

W przypadku zastosowania promieniowania UV należy pamiętać, że podobnie jak promieniowanie gamma, oddziałuje ono na DNA. Może między innymi przerywać ciągłość jednej albo obu nici DNA, powodować dimeryzację pirymidyn, zamiany albo utratę zasad azotowych czy zrywać wiązania wodorowe — „w tej metodzie problemem jest to, że różne części pożywki otrzymują różne dawki promieniowania. Jednakże dzięki zdobyczom najnowszych dostępnych technologii przeszkoda ta może zostać niebawem wyeliminowana” – mówiła Roulin. Obecnie najbardziej wydajne dekontaminatory UVivatec potrafią wysterylizować 480 L medium na godzinę.

 

Analiza SWOT metody napromieniowywania UV

Mocne strony

  • zaadaptowane dla skomplikowanych rozwiązań z wykorzystaniem filtrów,
  • łatwa zmiana skali,
  • bardzo efektywne przeciwko małym wirusom,
  • jednorazowe moduły.

Słabe strony

  • niedostatecznie wysokie wartości przepływu,
  • ponowne wykorzystanie materiałów jednorazowych,
  • nowa technologia.

Szanse

  • możliwość stosowania w przypadku delikatnych i trudnych do przefiltrowania cieczy.

Zagrożenia

  • rozmiary i koszty mogą stanowić problem przy większych objętościach,
  • wpływ na kultury i produkt.

 

Dobrą i skuteczną metodą dekontaminacji medium hodowlanego wydaje się być nanofiltracja. Najbardziej istotnym parametrem tej technologii jest precyzyjność wykorzystywanej membrany. Warto uświadomić sobie, że przeciętnej wielkości przeciwciała nie różnią się zbytnio rozmiarem od wirusów, a jednak membrana musi je odpowiednio posortować. „Jak dotąd nie zdarzyło się aby jakaś firma zgłosiła niepożądany wpływ nanofiltracji na swoje hodowle komórkowe. W przypadku tej metody należy jednak liczyć się wysoką ceną membran” — opowiadała Roulin.

 

 

Analiza SWOT metody nanofiltracji

 

Mocne strony

  • najbardziej niezawodna metoda,
  • jednorazowego użycia,
  • usuwa mykoplazmę,
  • łatwa u użyciu i skalowaniu,
  • nie wpływa na hodowlę komórkową.

Słabe strony

  • ograniczenia przepływu,
  • czasami ograniczona przesączalność,
  • wysokie koszty eksploatacyjne.

 

Szanse

  • procesy perfuzji,
  • suplementy o małych objętościach,
  • filtracja sterylnych mediów,
  • nowa generacja filtrów antywirusowych.

Zagrożenia

  • opłacalność przy wykorzystaniu w dużej skali.

 

„Zanieczyszczenie wirusami hodowli komórkowych może mieć zgubny wpływ na losy firmy, której się przytrafi. Tego typu zdarzenie może zagrozić relacjom firmy nie tylko z pacjentami, ale także z organami regulacyjnymi na danym rynku. Takie sytuacje miały już miejsce w przeszłości ‑— firmy zmuszone były do zamknięcia swoich linii produkcyjnych na dłuższy czas, co uniemożliwiło dostarczanie leków dla pacjentów ” — opowiadała Rouge. Szacuje się że tylko na jednym litrze zanieczyszczonej wirusami hodowli można stracić od 1 do 1,5 dolara.

 

Przy stosowaniu wymienionych metod profilaktyki przeciwwirusowej należy również brać pod uwagę inne czynniki mogące wpływać na bezpieczeństwo hodowli. Należy pamiętać o kontrolowaniu całego łańcucha dostaw, aby wszystkie stosowane pożywki, jak i inne odczynniki, były odpowiedniej jakości. Użyteczna okazuje się również analityka — powinno się regularnie sprawdzać, czy stosowana profilaktyka jest skuteczna; nie można także wykluczyć pojawienia się nowych rodzajów wirusów. Powinno się pamiętać o istotnej roli kroków podejmowanych, aby zapobiec zanieczyszczeniu wirusami i rzetelnie wywiązywać się ze wszystkich założeń mających zapewnić bezpieczeństwo kulturom komórkowym — nic nie zastąpi tradycyjnej rzetelności.

 

Red. Tomasz Domagała i Tomasz Sznerch

KOMENTARZE
Newsletter