Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Jak badać aktywność cytotoksyczną związków chemicznych?
Jak badać aktywność cytotoksyczną związków chemicznych?
Badanie związków chemicznych o potencjalnych zastosowaniu medycznym wymaga przeprowadzenia wielu testów biochemicznych. Jednym z podstawowych badań jest ustalenie aktywności cytotoksycznej danej substancji. Wstępne doświadczenia na poziomie in vitro nie mogą co prawda być w pełni równoznaczne z badaniami o charakterze in vivo. Stanowią jednak cenną informację o potencjalnym molekularnym mechanizmie działania związków w komórkach i są podstawą do dalszych eksperymentów w tym kierunku.

Metody służące ocenie stopnia cytotoksyczności związków chemicznych wykorzystują szereg różnych parametrów związanych z fizjologią komórek, w stosunku do których badana jest aktywność danych substancji. Należą do nich np. integralność błony komórkowej, proliferacja, aktywność komórkowych enzymów metabolicznych, jak również ilość białka lub materiału genetycznego.

Metodą wykorzystującą zmiany w integralności błony komórkowej jest bezpośredni pomiar żywotności komórek po uprzednim wybarwieniu ich, najczęściej błękitem trypanu lub czerwienią obojętną. Odróżnienie komórek martwych od żywych związane jest z możliwością gromadzenia się barwnika w odpowiednim miejscu komórki.

Błękit trypanu nie wnika do cytoplazmy komórek. Gromadzi się w okolicach błony komórkowej. Czerwień obojętna przedostaje się natomiast do cytoplazmy na zasadzie transportu biernego i gromadzi się w lizosomach żywych komórek.

W celu zbadania aktywności cytotoksycznej związków o potencjalnym zastosowaniu medycznym można również wykorzystać tzw. pośrednie testy pomiarowe, które związane są z aktywnością niektórych enzymów komórkowych.

Wśród takich enzymów jest mitochondrialne białko - dehydrogenaza bursztynianowa. Do testów, które mają na celu określenie jej aktywności należą MTT lub MTS. Mitochondrialna dehydrogenaza przekształca pomarańczową, rozpuszczalną w wodzie sól tetrazolową (bromek 3-(4,5-dimetylo-tiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazolu) do formazanu. Produkt reakcji w teście MTT nie rozpuszcza się w wodzie, a zatem metoda ta wymaga zastosowania rozpuszczalników organicznych.

W przypadku zastosowania procedury MTS, produkt powstaje w obecności metosiarczanu fenazyny (PMS, ang. phenazine methosulfate) i jest w pełni rozpuszczalny w wodzie. Test MTS stanowi zatem nieco ulepszoną alternatywę dla testu MTT. Formazan jest substancją barwną, a intensywność jego zabarwienia może być zmierzona przy użyciu spektrofotometru. Należy zwrócić uwagę, że formazan powstaje jedynie w przypadku, gdy mamy do czynienia z żywymi komórkami.

 

Ilość tego związku pozwala zatem na szybkie i stosunkowo dokładne oszacowanie przeżywalności komórek w obecności określonego stężenia badanego związku.

Podobną, kolorymetryczną metodą związaną z pomiarem absorbancji barwnego produktu reakcji enzymatycznej jest test LDH. W metodzie tej badana jest aktywność cytoplazmatycznego enzymu - dehydrogenazy mleczanowej. Zmiany w integralności błony komórkowej powodują, że dehydrogenaza wypływa do podłoża hodowlanego. Enzym ten przekształca znajdujące się w pożywce sole terazolowe w formazan. W odróżnieniu od testów MTT lub MTS, w tym przypadku powstawanie barwnego produktu związane jest jednak z wcześniejszą lizą komórki przez badany związek chemiczny.