Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Hodowle komórkowe w warunkach in vitro – media hodowlane
Hodowle komórkowe w warunkach in vitro – media hodowlane
Hodowle komórkowe stanowią obecnie jedną z ważniejszych technik powszechnie stosowanych w branży life science. Początki hodowli sięgają 1907 roku, kiedy to R. G. Harrison umieścił fragmenty tkanki nerwowej pochodzącej z zarodków żaby w kroplach zakrzepłej limfy. Od tego czasu nastąpił kolosalny rozwój technik hodowli komórek i tkanek, między innymi dzięki zastosowaniu oczywistych dziś warunków jałowych. W latach 50. ubiegłego wieku Harry Eagle opracował skład jednego z pierwszych mediów hodowlanych o ściśle określonym składzie chemicznym, MEM (ang. minimal essential medium). Jest to jedna z podstawowych pożywek, stosowanych także dziś w nowoczesnych laboratoriach.

Pożywka w hodowli komórek

Pożywka w hodowli komórkowej i tkankowej stanowi podstawowe środowisko wzrostu, które powinno jak najlepiej zastępować środowisko naturalnego występowania komórek. Stanowi źródło substancji odżywczych, w tym cukrów, aminokwasów, witamin, minerałów, ale także, poprzez właściwy skład, odpowiada za zachowanie pożądanego pH i osmolalności. Optymalny dobór medium hodowlanego stanowi kluczowy krok w procesie zapoczątkowania i prowadzenia hodowli komórkowej.

Podłoża hodowlane i ich skład

Media do hodowli komórek zwierzęcych można podzielić na 2 zasadnicze grupy: naturalne i sztuczne. Pożywki naturalne to płyny biologiczne takie jak limfa, osocze krwi, surowica. Powszechnie wykorzystywane w początkach hodowli komórek i tkanek, dziś są rzadko stosowane ze względu na skomplikowany, niestandaryzowany skład. Pożywki sztuczne, inaczej syntetyczne, uzyskuje się poprzez łączenie poszczególnych składników w ściśle określonych standaryzowanych proporcjach. Dostępne są w całej gamie modyfikacji, w proszku, liofilizowane, lub płynne, skoncentrowane lub nie, z możliwością suplementacji zależnej od wymagań konkretnej hodowli.

Podstawowym źródłem węgla dla komórek zwierzęcych w hodowli in vitrocukry. Najczęściej w pożywkach stosuje się glukozę, a także galaktozę, chociaż spotyka się również inne, na przykład maltozę lub fruktozę.

Aminokwasy są niezbędnym składnikiem wszystkich mediów, ponieważ komórki nie są w stanie ich syntetyzować, a ich dostępność konieczna jest dla proliferacji. Stężenie aminokwasów determinuje maksymalną możliwą do osiągnięcia gęstość komórek w hodowli. Najistotniejszym aminokwasem z punktu widzenia hodowli komórkowych jest L‑glutamina – źródło azotu między innymi do biosyntezy nukleotydów, NAD, NADPH, a także drugorzędowe źródło energii. L‑glutamina jest zwykle dodawana do pożywek bezpośrednio przed jej użyciem ze względu na niestabilność aminokwasu. Problem pojawia się w przypadku komórek wolno rosnących i trudnych w hodowli, kiedy pasażowanie musi odbywać się rzadko, a glutamina ulega już rozkładowi. W takiej sytuacji pomocne są dostępne na rynku substytuty glutaminy, o większej stabilności.

Ponadto, w skład pożywek wchodzą sole nieorganiczne, niezbędne do regulacji potencjału błonowego i ciśnienia osmotycznego, a także witaminy, pierwiastki śladowe. Często w praktyce laboratoryjnej dodawane są również antybiotyki. Ich dodatek nie jest niezbędny, jednak warunkuje silniejszą ochronę hodowli przed kontaminacją bakteryjną lub grzybową.

Każde medium hodowlane posiada odpowiedni system buforujący do regulacji zmieniającego się w trakcie prowadzenia hodowli pH środowiska wzrostowego komórek. Tanim, nietoksycznym sposobem jest regulacja pH pożywki poprzez system buforujący tworzony przez dwutlenek węgla obecny w atmosferze hodowli oraz jony węglanowe zawarte w pożywce. W takim przypadku naczynie hodowlane umieszczane jest w inkubatorze CO2, gdzie utrzymywana jest atmosfera 5‑10% dwutlenku węgla. Wówczas zachodzi równowaga pomiędzy gazowym CO2 a obecnymi w pożywce jonami węglanowymi oraz wodorowęglanowymi, co stabilizuję pH pożywki na poziomie około 7,4.

Innym sposobem jest buforowanie pożywki na drodze chemicznej za pomocą dostępnego na rynku czynnika HEPES. Nie jest wymagana wtedy kontrola atmosfery hodowli, jednak sam HEPES jest stosunkowo drogi. Ponadto wykazano, że w wyższych stężeniach HEPES może być toksyczny dla komórek - potwierdzono efekty fitotoksyczne w postaci powstawania nadtlenku wodoru pod wpływem światła.

Większość komercyjnie dostępnych pożywek zawiera dodatkowo wskaźnik pH w postaci czerwieni fenolowej, co pozwala łatwo monitorować zmiany kwasowości środowiska hodowli.

Surowica

W praktyce laboratoryjnej pożywki syntetyczne bardzo często suplementuje się surowicą, która stanowi kompleksową mieszaninę soli mineralnych, lipidów, węglowodanów, pierwiastków śladowych (cynk, selen, miedź), a przede wszystkim takich biomolekuł jak czynniki wzrostu, hormony, albuminy, czynniki adhezyjne. Surowica jest niezwykle cennym uzupełnieniem sztucznych pożywek o określonym składzie i stymuluje wzrost niemal wszystkich rodzajów komórek. Czynniki adhezyjne ułatwiają funkcjonowanie komórek w naczyniach hodowlanych, podczas gdy albuminy i trasferyny warunkują odpowiednią biodostępność innych składników, między innymi witamin i hormonów. Dodatek surowicy wpływa korzystnie na właściwości buforujące pożywki, a także zwiększa korzystnie jej lepkość, co powoduje ochronę komórek przed uszkodzeniami mechanicznymi w trakcie mieszania zawiesiny. Najczęściej stosuje się dodatek kilku do 20% surowicy do pożywki syntetycznej. Popularnie wykorzystywana jest płodowa surowica bydlęca (FBS, ang. fetal bovine serum), ale również surowica końska czy barania.

Pomimo licznych zalet stosowania surowicy, która zawiera cenne związki w fizjologicznych, sprzyjających wzrostowi proporcjach, istnieją także wady jej dodawania do mediów hodowlanych. W surowicy mogą występować związki toksyczne, a także inhibitory wzrostu, chociaż ich ilość jest zwykle bardzo niewielka. Poza tym stosowanie surowicy może powodować wzrost ryzyka kontaminacji hodowli komórkowej, co dotyczy przede wszystkim zakażeń grzybami bądź mykoplazmą. Producenci oczywiście zobowiązani są do badania czystości produktu, jednak zaleca się także dodatkowe testowanie surowic już w laboratoriach badawczych. Podobnie jak naturalne pożywki i inne suplementy, w surowicy wahaniom ulega zawartość poszczególnych składników, w zależności od serii, zwierząt, od których pochodzi, a nawet ich zdrowia, pożywienia czy sezonu. W oczywisty sposób utrudnia to pełną standaryzację składu podłoża hodowlanego. Niektóre związki występujące w surowicach mogą wpływać niekorzystnie na procesy izolacji i oczyszczania komórek bądź ich składników. Wreszcie surowica jest stosunkowo drogim suplementem.

Ze względu na niedogodności związane ze stosowaniem surowicy, niektóre hodowle mogą wymagać wykorzystywania pożywek pozbawionych jej dodatku (SFM, ang. serum free medium) lub o takich właściwościach, które pozwalają na minimalizację dodatku surowicy. Dostępne są na rynku pożywki o ściśle określonym składzie chemicznym, zawierające odpowiedni dodatek czynników wzrostu, albumin, lipidów i pierwiastków śladowych, których właściwości powodują, że suplementowanie surowicą nie jest niezbędne dla wzrostu komórek. Co więcej, producenci oferują także substytutu surowicy, zawierające mniej endotoksyn i nieokreślonych składników białkowych, a przy tym są bardziej stabilne. Mogą być otrzymywane z osocza zwierząt.

Podstawowe pożywki

W badaniach na liniach komórkowych wykorzystywane są różnego typu media, dostępne w różnych formach i modyfikacjach. Do najbardziej popularnych zalicza się:

  • MEM (minimal essential medium) lub EMEM (Eagle’s minimal essential medium). Jest to jedna z podstawowych pożywek, której skład opracował Harry Eagle w połowie ubiegłego wieku. Zawiera sole nieorganiczne, aminokwasy, pirogronian sodu, a ponadto taką zawartość jonów węglanowych, która wymaga prowadzenia hodowli w atmosferze 5% dwutlenku węgla. Podłoże nie jest kompleksowe, jednak po odpowiedniej suplementacji nadaje się do hodowli wielu typów komórek ssaczych.
  • DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium). Pożywka ta zawiera 4‑krotnie więcej witamin i 2‑krotnie więcej aminokwasów niż MEM. Jest wzbogacona także pod względem zawartości pirogronianu i glukozy, której to stężenie optymalne do wzrostu większości typów komórek określono na 4500 mg/L. Zwykle suplementowana jest dodatkiem 5‑10% płodowej surowicy bydlęcej. Pierwotnie była używana do hodowli embrionów mysich.
  • RPMI‑1640. Jest to medium hodowlane opracowane w Roswell Park Memorial Institute, jako modyfikacja innej pożywki, McCoy’s 5A. Pożywka RPMI‑1640 jest nieco bardziej zasadowa niż inne popularne media (pH 8). Nadaje się do hodowli wielu rodzajów komórek ssaczych, zarówno rosnących w zawiesinie, jak i w postaci monowarstwy, w szczególności jednak do hodowli komórek hematopoetycznych i limfocytów. Wymaga suplementacji surowicą.
  • Ham’s Nutrient Mixture. Pożywkę tę opracowano z myślą o hodowli komórek jajnika chomika chińskiego (CHO, ang. Chinese hamster ovary). Z czasem powstały jej liczne modyfikacje do zastosowań z surowicą lub bez jej dodatku. Najpopularniejsze modyfikacje to Ham’s F‑10, Ham’s F‑12, stosowane na przykład w hodowli komórek tkanki kostnej lub komórek mięśni szkieletowych.

Przedstawione rodzaje mediów do hodowli komórek w warunkach in vitro, choć stosowane z powodzeniem od wielu lat, stanowią tylko niewielki ułamek możliwych wariantów. Każdą z wyjściowych pożywek można bowiem według potrzeb poddawać suplementacji: aminokwasami, surowicą, antybiotykami. Niemal każdy rodzaj podłoża można nabyć w postaci płynnej lub w postaci proszku. W zależności od potrzeb, rynek oferuje klientom pożywki zawierające różne stężenia poszczególnych składników, przede wszystkim cukru czy glutaminy. Taka optymalizacja składu i właściwości jest obecnie największym wyzwaniem w odniesieniu do nowoczesnych mediów hodowlanych. Na rynku pojawiły się serwisy umożliwiające klientowi na przykład zamówienie gotowej pożywki o spersonalizowanym składzie w niemal dowolnej objętości, a także pomoc w optymalizacji tego składu.

Właściwy dobór składników optymalizowanej pożywki i ich proporcji jest jednak niezwykle skomplikowany. Należy pamiętać o nieznanych, niespodziewanych zależnościach, jakie mogą zachodzić pośrednio pomiędzy składnikami, co wynika ze złożoności szlaków metabolicznych w komórce. Tym nie mniej przy zakupie istniejących i znanych linii komórkowych z kolekcji zostaniemy zawsze poinformowani o optymalnym typie podłoża dla danego rodzaju hodowli.

Źródła

S. Stokłosowa, praca zbiorowa, Hodowla komórek i tkanek, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2011

A. Meenakshi, Cell culture media: A review, www.labome.com

B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis, Molecular biology of the cell, Garland Science, 2002

F. Godia et al., Improvement of CHO cell culture medium formulation: Simultaneus substitution of glucose and glutamine, Biotechnol. Prog. 2000

J.L. Lepe-Zuniga, J.S. Zigler, I Gery, Toxicity of light-exposed Hepes media, J. Immunol. Methods 103, 1987

www.sigmaaldrich.com

www.lifetechnologies.com

www.atcc.com

KOMENTARZE
Newsletter