Enzymy jako bioreceptory

Jedną z funkcji enzymów, która może być z powodzeniem wykorzystana w chemii analitycznej, jest kataliza. Enzymy biorą udział w szeregu procesów jako bioreceptory. W tym przypadku ich dużą zaletą jest selektywność w stosunku do wybranych analitów. Enzymy wyszukują je w układzie reakcyjnym, gdzie określone składniki są substratami, a następnie katalizują ich przemiany. Z punktu widzenia chemii analitycznej szczególnie korzystne jest to, co dzieje się w kolejnym kroku, czyli biokonwersji. Enzymy oprócz selektywnego katalizowania pożądanych analitów przekształcają je w pochodne, które mogą zostać poddane detekcji wybranymi technikami analitycznymi.

Ogólnymi przykładami takich biokonwersji są np. przekształcenie bezbarwnych składników w barwne, substancji niejonowych w jonowe itp. Można również zaobserwować procesy fluorescencji lub otrzymywany jest sygnał chemiluminescencyjny. Enzymy jako bioreceptory mają zdolność do rozpoznawania np. inhibitorów. W tym przypadku nie zachodzi reakcja biokatalizy, a obserwowane jest zmniejszenie aktywności enzymu. Z tego względu oznaczanie inhibitorów z wykorzystaniem enzymów ma charakter pośredni. W procesach tych enzym jest reagentem. Jako receptor rozpoznaje w układzie inhibitor i wskutek tego zmniejsza się jego aktywność, proporcjonalnie do stężenia inhibitora.

Enzymy jako anality

Zgodnie z definicją analit to składnik badanego materiału (próbki), który jest wykrywany i ilościowo oznaczany wybraną procedurą analityki chemicznej. Biorąc pod uwagę powyższą definicję, enzymy nie są typowymi analitami, ponieważ nie oznacza się ich ilości, a wyznacza się ich aktywność enzymatyczną. Takie postępowanie największe znaczenie ma w diagnostyce klinicznej, gdzie bada się aktywność enzymów np. w tkankach pacjentów. Uzyskane dane dostarczają niezwykle ważnych biomedycznych informacji, które pozwalają zbadać kondycję zdrowotną pacjenta, rozwój chorób czy skuteczność wdrożonego leczenia. Oznaczanie enzymów odnosi się do jednostkowej objętości badanego materiału. W efekcie, w trakcie pracochłonnej procedury analitycznej, wyznaczana jest aktywność enzymatyczna próbki. Aby wyznaczyć aktywność enzymatyczną, należy podać szereg parametrów (m.in. czas, temperaturę, pH, skład roztworu i inne), które wskazują warunki przebiegu reakcji katalizowanej przez rozpatrywany enzym. W trakcie tej procedury enzym nie jest poddawany oznaczeniu, a detekcji ulega produkt reakcji enzymatycznej.

Jedną z technik wyznaczania aktywności enzymatycznej jest technika fluorescencyjna. W tym celu stosowane są substraty fluorogeniczne, tzw. prefluorofory. Ich zadaniem jest przedostanie się do wnętrza komórki i emitowanie światła, które ulega detekcji za pomocą np. czytnika fluorescencji. Sam proces wniknięcia fluoroforów do komórek jest wspomagany działaniem enzymów i na tej podstawie określana jest następnie jego aktywność enzymatyczna. Wśród innych metod wyznaczania aktywności enzymatycznej dominują techniki instrumentalne (spektrofotometryczne, potencjometryczne, polarymetryczne), ale stosowane są także miareczkowe.

Enzymy jako znaczniki

Zastosowanie enzymów jako znaczników najogólniej można określić jako umożliwienie wykrycia obecności innego, ważnego składnika w badanym układzie. W tym przypadku jedną z najważniejszych kwestii jest, w jakich reakcjach bierze udział dany enzym, gdyż stwierdzenie przebiegu wybranych procesów potwierdza obecność określonych, ważnych składników, których detekcja innymi metodami jest niezwykle trudna lub czasami wręcz niemożliwa. Co istotne, detekcji w tym przypadku można dokonać na szereg sposobów. Najczęściej do tego celu wykorzystuje się metody fotometryczne. Enzymy jako znaczniki mają wiele zalet, gdzie najważniejszymi są wysoka czułość i selektywność.

Możliwość zastosowania enzymów jako znaczników została wykorzystana m.in. w testach immunoenzymatycznych ELISA. Służą one do wykrywania i ilościowego oznaczania substancji, takich jak peptydy, białka, przeciwciała czy hormony. W badaniach biomedycznych w ośrodkach naukowych i punktach diagnostycznych jest uznawana za popularną metodę analityczną ze względu na prostotę, dokładność, możliwość zautomatyzowania czy stosunkowo niską cenę. Idea testu ELISA opiera się na tworzeniu wiązań pomiędzy antygenem a przeciwciałem. Ich obecność jest widoczna dzięki zachodzeniu reakcji barwnej wykorzystującej enzymy. Nasilenie barwy zwykle jest mierzone metodą kolorymetryczną. Mimo że opracowano szereg wariantów tego testu, schemat postępowania jest taki sam. Wykorzystywane znaczniki enzymatyczne to najczęściej peroksydaza i fosfataza alkaliczna.